Extração do Cofactor _F420 para Análise do Comprimento da Cauda poliglutama de culturas puras e amostras ambientais

_F420 é um cofator generalizado, mas muitas vezes negligenciado, que funciona como um portador obrigatório de hidreto de dois elétrons em processos metabólicos primários e secundários tanto da Archaea quanto das ^{Bactérias1,2}. _F420 é um 5-deazaflavin e estruturalmente semelhante aos flavins, pelo qual suas propriedades químicas e biológicas são mais comparáveis com as de NAD⁺ ou NADP⁺. Devido à substituição de nitrogênio por carbono na posição 5 do anel isoalloxazine, é um forte redutivo, apresentando assim um baixo potencial de redox padrão de -340 ^mV1,3. _F420 compreende um anel 5-deazaflavin e um linker 2-fospho-L-lactato (_F420-0). Uma cauda oligoglutamate contendo monômeros de glutamato n+1 pode ser anexada à molécula (_F420-n+1)⁴.

Por muito tempo, o cofator _F420 tem sido associado exclusivamente com Archaea e Actinobacteria. Isso foi em grande parte anulado. Análises recentes revelaram que o _F420 está distribuído entre diversos organismos anaeróbicos e aeróbicos da filo Proteobacteria, Cloroflexi, e potencialmente firmicutes que habitam uma miríade de habitats como solos, lagos e intestino ^humano1,5. Em 2019, Braga et ^al.6, mostraram que o proteobacterium Paraburkholderia rizoxinica produz um derivado _F420 único, contendo um 3-fosfoglicerate em vez de uma cauda de 2 fosfolactato, que pode ser difundida em vários habitats. Dentro do domínio Archaea, _f420 foi encontrado em várias linhagenias, incluindo methanogenic7, methanotrófico8,9, e ordens redutoras de sulfato10, e deve ser produzido em Thaumarchaeota11. _F420 é mais conhecido como uma coenzima redox essencial em methanogênese metilotrófica e metilotrófica. A forma reduzida de _F420 (_F420H2) funciona como um doador de elétrons para a redução de metilenotetrahidromedromedetina (metileno-H4MPT, Mer) e mehenyl-H4MPT12,13. Também pode ser usado como um porta-elétrons em vias de transporte de elétrons independentes de _H2 de methanogênios contendo citocromes12,14. Além disso, a forma oxidada de _F420 tem uma fluorescência azul-esverdeada característica após a excitação a 420 nm, o que facilita a detecção de methanogênios microscopicamente (Figura 1). Devido ao seu baixo potencial de redox, _f420 facilita (i) a redução exógena de um amplo espectro de compostos orgânicos recalcitrantes ou tóxicos, (ii) síntese de antibióticos tetracítricos e lincosamidas ou fitotoxinas em estreptomices (filo Actinobacteria), e (iii) resistência ao estresse oxidativo ou nitrosativo ou outras condições desfavoráveis em micobactérias (filo Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Consequentemente, os oxidoreductases dependentes de _F420 são biocatalysts promissores para fins industriais e farmacêuticos, bem como para a bioremediação de ambientes ^{contaminados1,23}. Apesar dessas descobertas recentes, os papéis exatos do cofator _F420 ainda são marginalmente conhecidos em Actinobacteria ou outras bactérias.

Há pelo menos três caminhos para a biosíntese _F4202,6,24. No início, a via da biossíntese é dividida em uma biosíntese de 5 deazaflavinas e um ramo metabolismo de 2 fosfolactato. A parte reativa da molécula _F420 é sintetizada via _FO-synthase usando os substratos tyrosine e 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinadiona. O resultado é o nível de riboflavina cromohore _FO. Dentro do ramo de metabolismo de lactato atualmente aceito, o L-lactato é fosfoilado a 2-phospho-L-lactato por um L-lactato kinase (CofB); 2-phospho-L-lactato, por sua vez, é guanylated para L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine por 2-phospho-L-lactate guanylyltransferase (CofC). No próximo passo, L-lactil-2-diphospho-5′-guanosine é ligado à _FO por um 2-phospho-L-lactato transferase (CofD) para formar _F420-02. Finalmente, a enzima _F420-0:ɣ-glutamyl liga os monômeros glutamato para _F420-0, formando o cofator ^final6 em números variados23,25. Diferentes organismos apresentam padrões diferentes no número de resíduos de glutamato anexados, com caudas mais curtas encontradas para methanogênios do que em micobactérias2,25,26. Geralmente, os metanogens mostram comprimentos de cauda de dois a três, com até cinco no metanogena actolástico, methanosarcina sp., enquanto os comprimentos da cauda encontrados em Mycobacterium sp. variaram de cinco a sete resíduos de glutamato2,25,26,27. No entanto, descobertas recentes mostraram que a _F420 de cadeia longa se liga a oxidoreductases dependentes da _F420 com uma afinidade maior do que a _F420 de cadeia curta; além disso, o _F420 de cadeia longa ligado aumenta a afinidade do substrato, mas diminui a taxa de rotatividade das respectivas ^enzimas23.

A detecção do cofato _F420 é frequentemente baseada em sua fluorescência. Assim, seus derivados de glutamato oligo foram separados por meio de fase inversa (RP)-^HPLC27,28. Recentemente, Ney et al. usaram hidróxido de tetrabutylammonium como um reagente de emparelhamento de íons para a cauda de glutamato carregada negativamente para melhorar a separação em RP-HLPC com ^sucesso5. Aqui, apresentamos um método para a preparação de amostras, posteriormente, extração, purificação, separação e quantificação do cofato _F420 não apenas de culturas puras, mas também de diferentes amostras ambientais (ou seja, solos e lodo digestor).