メタノゲン純粋培養物と環境試料からのポリグルタミン酸尾長の分析のための補因子_F420 の抽出

_F420は、広く普及しているが、しばしば無視された補因子であり、これは、古細菌および細菌^1,2の両方の一次および二次代謝プロセスにおける義務的な2電子水素化物担体として機能^する。_F420は5-デアザフラビンであり、構造的にはフラビンに類似しており、それによってその化学的および生物学的特性はNAD⁺またはNADP⁺のものとより同等である。イソロキサジン環の位置5で窒素と炭素を置換するため、それは強力な還元剤であり、したがって-340 ^mV1,3の低標準酸化還元電位を示す。_F420は、5-デアザフラビン環と2-ホスホ-L-乳酸リンカーを含む(_F420-0)。n+1グルタミン酸モノマーを含むオリゴグルタミン酸尾を分子に結合させることができる(_F420-n+1)⁴。

長い間、補因子_F420は、単に古細菌とアクチノバクテリアと関連付けられてきた。これは主に覆されています。最近の分析では、_F420はフィラプロテオバクテリア、クロロルレクシの多様な嫌気性および好気性生物の間に分布し、土壌、湖、人間の腸のような無数の生息地に生息する可能性のあるフィルミキュートが明らかになりました^1,5.2019年、Bragaら.⁶は、プロテオバクテリウムパラブルクホルデリア・リゾキシニカが、様々な生息地で広まっている可能性のある2-ホスホラクテート尾の代わりに3-ホスホグリセリン酸を含むユニークな_F420誘導体を産生することを示した。ドメインアルカエアの中で、_F420は、メタノジェニック⁷、メトトロ^ピー8、9、硫酸還元^{オーダー10}を含むいくつかの系統で発見されており、タウマルカエオタ¹¹で生産されることになっている。_F420は、水素栄養学およびメチロトローフ性メタン新生において必須のレドックス補酵素として最もよく知られている。_F420(F420H2)の還元形態は、メチレンネテトラヒドロメタノプテリン(メチレン-_H4MPT、Mer)およびメテニル_H4MPT12,13の還元のための電子ドナーとして機能する。また、シトクロム^12,14を含有するメタノゲンの_H2非依存性電子輸送経路における電子担体として用いることができる。さらに、_F420の酸化型は、420nmでの励起時に特徴的な青色・緑色蛍光を有し、微小微小の微小化した微量体原の検出を容易にする(図1)。その低い酸化還元電位のために、_F420は(i)それ以外の場合は再カルシタントまたは有毒な有機化合物の広いスペクトルの外因性減少を促進し、 (ii)ストレプトマイセテ(フィラムアクチノバクテリア)におけるテトラサイクリンおよびリンコサミド抗生物質またはフィトトキシンの合成、および(iii)抗酸菌(フィラムアクチノバクテリア^{)における}酸化またはニトロ化ストレスまたはその他の不利な状態に対する耐性^、 16,17,18,19,20,21,22.その結果、_F420依存性酸化還元酵素は、工業および製薬の目的および汚染された環境のバイオレメディエーションのための有望な生体触媒^{である1,23}。これらの最近の知見にもかかわらず、補因子_F420の正確な役割は、アクシノバクテリアまたは他の細菌フィラでまだわずかに知られている。

_F420生合成には少なくとも3つの経路があります^2,6,24。初めに、生合成経路は5-デアザフラビン生合成および2-ホスホラク酸代謝分岐に分割される。_F420分子の反応性部分は、フィロシンと5-アミノ-6-リビチルアミノ-2,4(1H, 3H)-ピリミジンジオンの基質を用いて_FO-シンターゼを介して合成される。結果はリボフラビンレベルのクロモフォア_FOです。現在受け入れられている乳酸代謝ブランチ内では、L-乳酸はL-乳酸キナーゼ(CofB)によって2-ホスホ-L-乳酸にリン酸化される。2-ホスホ-L-乳酸は、今度は、2-ホスホ-L-乳酸グアニリルトランスファーゼ(CofC)によってL-ラクチル-2-ジホスホ-5′-グアノシンにグアニル化される。次のステップでは、L-ラクチル-2-ジホスホ-5′-グアノシンは、_F420-02を形成する2-ホスホ-L-乳酸トランスファーゼ(CofD)によって_FOにリンクされています。最後に、酵素_F420-0:ɣグルタミルリガーゼ(CofE)はグルタミン酸モノマーを_F420-0にリゲートし、異なる数^23,25で最終的な補因子⁶を形成する。異なる生物は、ミコバクテリア^2,25,26よりも安価な尾がメサノゲンに見られる短い尾で、付着したグルタミン酸残基の数で異なるパターンを示^す。一般的に、メタノゲンは2から3までの尾の長さを示し、アセトクラス性メタノゲン、メサノサルシナsp.で最大5つ、マイコバクテリウムspに見られる尾長は5〜7個のグルタミン酸残基^2,25,26,27の範囲でした。しかし、最近の知見では、長鎖_{F420が短鎖F420}よりも高い親和性を有する_F420依存性オキシド還元酵素に結合することが示された。また、結合長鎖_F420は基質親和性を高めるが、それぞれの酵素²³の回転率を低下させる。

補因子_F420の検出は、多くの場合、その蛍光に基づいています。それにより、そのオリゴグルタミン酸誘導体を逆相(RP)-^HPLC27,28を用いて分離した。最近、Ney et al. は、負に荷電したグルタミン酸尾のイオン対向試薬として水酸化テトラブチラモニウムを使用し、RP-HLPC上での分離を正常に促進した⁵。ここでは、純粋な培養物からだけでなく、異なる環境サンプル(土壌および消化剤汚泥)からの補因子_F420のサンプル、その後のリシス、抽出、精製、分離、定量の調製方法を提示する。