Estrazione del cofattore _F420 per l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali

_F420 è un cofattore diffuso ma spesso trascurato, che funziona come un vettore obbligato di idruro a due elettroni nei processi metabolici primari e secondari sia di Archaea che di ^Bacteria1,2. _F420 è una 5-deazaflavina e strutturalmente simile alle flavine, per cui le sue proprietà chimiche e biologiche sono più paragonabili a quelle di NAD⁺ o NADP⁺. A causa della sostituzione dell’azoto con il carbonio in posizione 5 dell’anello isoallossiazinico, è un forte riducente, esibendo così un basso potenziale redox standard di -340 ^mV1,3. _F420 comprende un anello 5-deazaflavina e un linker 2-fosfo-L-lattato (_F420-0). Una coda oligoglutammata contenente n+1 monomeri di glutammato può essere attaccata alla molecola (_F420-n+1)⁴.

Per molto tempo, il cofattore _F420 è stato associato esclusivamente ad Archaea e Actinobacteria. Questo è stato in gran parte ribaltato. Recenti analisi hanno rivelato che _F420 è distribuito tra diversi organismi anaerobici e aerobici dei phyla Proteobacteria, Chloroflexi e potenzialmente Firmicutes che abitano una miriade di habitat come suoli, laghi e intestino ^umano1,5. Nel 2019, Braga et ^al.6, hanno dimostrato che il proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica produce un derivato _F420 unico, contenente un 3-fosfoglicerato invece di una coda 2-fosfolactato, che potrebbe essere diffuso in vari habitat. All’interno del dominio Archaea, _F420 è stato trovato in diversi lignaggi, tra cui metanogenico7, metanotrofico8,9 e ordini di riduzione del solfato10, e si suppone che sia prodotto in Thaumarchaeota11. _F420 è meglio conosciuto come un coenzima redox essenziale nella metanogenesi idrogenotrofica e metilotrofica. La forma ridotta di _F420 (_F420H2) funziona come donatore di elettroni per la riduzione della metilenetetraidrometanopterina (metilene-H4MPT, Mer) e del metile-H4MPT12,13. Può anche essere usato come vettore di elettroni in vie di trasporto di elettroni indipendenti da _H2 di metanogeni contenenti citocromi12,14. Inoltre, la forma ossidata di _F420 ha una caratteristica fluorescenza blu-verde all’eccitazione a 420 nm, che facilita la rilevazione dei metanogeni al microscopio (Figura 1). Grazie al suo basso potenziale redox, _F420 facilita (i) la riduzione esogena di un ampio spettro di composti organici altrimenti recalcitranti o tossici, (ii) la sintesi di antibiotici tetracicline e lincosamide o fitotossine negli streptomiceti (phylum Actinobacteria) e (iii) la resistenza allo stress ossidativo o nitrosativo o ad altre condizioni sfavorevoli nei micobatteri (phylum Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Di conseguenza, le ossidoreduttasi _{F420-dipendenti} sono biocatalizzatori promettenti per scopi industriali e farmaceutici, nonché per il biorisanamento di ambienti ^{contaminati1,23}. Nonostante queste recenti scoperte, i ruoli esatti del cofattore _F420 sono ancora marginalmente noti negli Actinobacteria o in altri phyla batterici.

Esistono almeno tre percorsi per la biosintesi _F4202,6,24. All’inizio, la via della biosintesi è divisa in una biosintesi a 5-deazaflavina e un ramo del metabolismo a 2-fosfolattato. La parte reattiva della molecola _F420 viene sintetizzata tramite _FO-sintasi utilizzando i substrati tirosina e 5-ammino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pirimidinedione. Il risultato è il cromoforo _FO a livello di riboflavina. All’interno del ramo del metabolismo del lattato attualmente accettato, L-lattato è fosforilato a 2-fosfo-L-lattato da una L-lattato chinasi (CofB); Il 2-fosfo-L-lattato, a sua volta, è guanilato a L-lattil-2-difosfo-5′-guanosina dalla 2-fosfo-L-lattato guanililtransferasi (CofC). Nella fase successiva, L-lattil-2-difosfo-5′-guanosina è collegata a _FO da una 2-fosfo-L-lattato transferasi (CofD) per formare _F420-02. Infine, l’enzima _F420-0:ɣ-glutamil ligasi (CofE) lega i monomeri di glutammato a _F420-0, formando il cofattore ^finale6 in numeri ^{variabili23,25}. Organismi diversi mostrano modelli diversi nel numero di residui di glutammato attaccati, con code più corte trovate per i metanogeni rispetto ai micobatteri2,25,26. Generalmente, i metanogeni mostrano lunghezze della coda da due a tre, con fino a cinque nel metanogeno acetoclastico, Methanosarcina sp., mentre le lunghezze della coda trovate in Mycobacterium sp. variavano da cinque a sette residui di glutammato2,25,26,27. Tuttavia, recenti scoperte hanno mostrato che _F420 a catena lunga si lega alle ossidoreduttasi _{F420-dipendenti} con un’affinità maggiore rispetto alla _F420 a catena corta; inoltre, il legato A catena lunga _F420 aumenta l’affinità del substrato ma diminuisce il tasso di turnover dei rispettivi ^enzimi23.

Il rilevamento del cofattore _F420 è spesso basato sulla sua fluorescenza. In tal modo, i suoi derivati oligo glutammato sono stati separati utilizzando LA fase inversa (RP)-^HPLC27,28. Recentemente, Ney et al. hanno utilizzato l’idrossido di tetrabutilammonio come reagente di accoppiamento ionico per la coda di glutammato caricata negativamente per migliorare con successo la separazione su RP-HLPC5. Qui, presentiamo un metodo per la preparazione di campioni, successiva lisi, estrazione, purificazione, separazione e quantificazione del cofattore _F420 non solo da colture pure ma anche da diversi campioni ambientali (cioè terreni e fanghi del digestore).