הפקת קופקטור _F420 לניתוח אורך זנב פוליגלוטאמט מתרבויות טהורות מתנוגניות ודגימות סביבתיות

_F420 הוא קופקטור נפוץ אך מוזנח לעתים קרובות, המתפקד כנשא הידריד דו-אלקטרוני מחייב בתהליכים מטבוליים ראשוניים ומשניים של ארכיאה וחיידק1,2. _F420 הוא 5-דיזפלבין ודומה מבחינה מבנית flavins, לפי תכונותיו הכימיות והביולוגיות דומים יותר עם אלה של NAD ⁺ או NADP ⁺. בשל החלפת חנקן עם פחמן במיקום 5 של טבעת isoalloxazine, הוא רדויטנט חזק, ובכך מציג פוטנציאל redox סטנדרטי נמוך של -340 ^mV1,3. _F420 כולל טבעת 5-דיזפלבין ומקשר 2-phospho-L-לקטט (_F420-0). זנב אוליגלוטאמט המכיל n+1 מונומרים גלוטמט יכול להיות מחובר למולקולה (_F420-n +1)⁴.

במשך זמן רב, _F420 קופקטור היה קשור אך ורק עם ארכאיה ו Actinobacteria. זה התהפך ברובו. ניתוחים אחרונים גילו כי _F420 מופץ בין אורגניזמים אנאירוביים ואירוביים מגוונים של פילה פרוטאובקטריה, כלורופלקסי, וייתכן ש- Firmicutes המאכלסים מספר עצום של בתי גידול כמו קרקעות, אגמים, והמעיים האנושיים1,5. בשנת 2019, בראגה ^ואח’6, הראו כי פרוטאובקטריום Paraburkholderia rhizoxinica מייצר נגזרת _F420 ייחודית, המכילה 3-פוספוגליצרט במקום זנב 2-פוספט, אשר עשוי להיות נפוץ בבתי גידול שונים. בתוך התחום Archaea, _F420 נמצא במספר שושלות, כולל methanogenic7, מתאנוטרופיק8,9, והזמנות להפחתת ^{גופרית10}, והוא אמור להיות מיוצר Thaumarchaeota11. _F420 ידוע בעיקר בשם קואנזים אדום חיוני במתנוגנזה מינוטרופית ומתילוטרופית. הצורה המופחתת של _F420 (_F420H2) מתפקדת כתורמת אלקטרונים להפחתת מתילנטרהידרומתנופטרין (מתילן-H4MPT, מר) ומתניל-H4MPT12,13. זה יכול לשמש גם כנשא אלקטרונים במסלולי הובלת אלקטרונים עצמאיים _H2 של מתנוגנים המכילים ציטוכרום12,14. יתר על כן, הצורה החמצונית של _F420 יש פלואורסצנטיות כחולה-ירוקה אופיינית עם עירור ב 420 ננומטר, אשר מאפשר זיהוי של מתנוגנים מיקרוסקופיים (איור 1). בשל פוטנציאל redox הנמוך שלה, _F420 מאפשר (i) הפחתה אקסוגנית של ספקטרום רחב של תרכובות אורגניות סרבנות או רעילות אחרת, (ii) סינתזה של טטרציקלין ואנטיביוטיקה לינקוסמיד או פיטוטוקסינים בסטרפטומיאצטים (פילום אקטינובקטריה), ו -(iii) עמידות ללחץ חמצוני או ניטרוסטיבי או תנאים שליליים אחרים במיקובקטריה (פילום אקטינובקטריה)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. כתוצאה מכך, חמצון תלוי _F420 הם biocatalysts מבטיחים למטרות תעשייתיות ותרופות, כמו גם עבור תיווך ביולוגי של סביבות ^{מזוהמות1,23}. למרות הממצאים האחרונים, התפקידים המדויקים של _F420 קופקטור עדיין ידועים בשוליים Actinobacteria או פילה חיידקי אחר.

ישנם לפחות שלושה מסלולים לביוסינתזה _F4202,6,24. בהתחלה, מסלול הביוסינתזה מחולק לביוסינתזה של 5-דיזפלבין וענף חילוף חומרים של 2-פוספולקטאט. החלק הריאקטיבי של מולקולת _F420 מסונתז באמצעות _{FO-סינתאז} באמצעות טירוזין המצע ו 5-אמינו-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione. התוצאה היא רמת הריבופלבין כרומופור _FO. בתוך ענף חילוף החומרים לקטט המקובל כיום, L-לקטט הוא זרחן 2-phospho-L-לקטט על ידי קינאז L-לקטט (CofB); 2-פוספו-L-לקטט, בתורו, הוא guanylated ל L-לקטיל-2-דיפוספו-5′-גואנוסין על ידי 2-פוספו-L-לקטט guanylyltransferase (CofC). בשלב הבא, L-לקטיל-2-דיפוספו-5′-גואנוסין מקושר ל- _FO על ידי טרנספראז 2-phospho-L-לקטט (CofD) ליצירת _F420-02. לבסוף, האנזים _F420-0:ɣ-גלוטמיל ליגאז (CofE) ליגאטות גלוטמט מונומרים ל- _F420-0, ויוצר את קופקטור ^הסופי6 במספרים ^{משתנים23,25}. אורגניזמים שונים מראים דפוסים שונים במספר שאריות גלוטמט מחוברות, עם זנבות קצרים יותר שנמצאו עבור מתנוגנים מאשר mycobacteria2,25,26. בדרך כלל, מתנוגנים מראים אורך זנב משניים עד שלושה, עם עד חמישה מתנוגן אצטוקלסטי, מתנוזרצ’ינה sp., בעוד אורכי הזנב שנמצאו Mycobacterium sp. נע בין חמישה לשבע שאריות גלוטמט2,25,26,27. עם זאת, הממצאים האחרונים הראו כי _F420 ארוך שרשרת נקשר חמצון תלוי _F420 עם זיקה גבוהה יותר מאשר _F420 קצר שרשרת; יתר על כן, _F420 קשור שרשרת ארוכה מגביר את הזיקה מצע אבל מקטין את שיעור המחזור של אנזימים ^{בהתאמה23}.

זיהוי של קופקטור _F420 מבוסס לעתים קרובות על הפלואורסצנטיות שלו. ובכך, נגזרי הגלוטמט אוליגו שלה הופרדו באמצעות שלב הפוך (RP)-^HPLC27,28. לאחרונה, Ney ואח ‘ השתמש tetrabutylammonium הידרוקסיד כמו ריאגנט זיווג יונים עבור זנב גלוטמט טעון שלילי כדי לשפר את ההפרדה על RP-HLPC ^{בהצלחה5}. כאן, אנו מציגים שיטה להכנת דגימות, תמוגה לאחר מכן, מיצוי, טיהור, הפרדה וכימות של קופקטור _F420 לא רק מתרבויות טהורות אלא גם מדגימות סביבתיות שונות (כלומר, קרקעות בוצה מעכל).