Extraktion von Cofaktor _F420 zur Analyse der Polyglutamat-Schwanzlänge aus methanogenen Reinkulturen und Umweltproben

_F420 ist ein weit verbreiteter, aber oft vernachlässigter Cofaktor, der als obligater Zwei-Elektronenhydrid-Träger in primären und sekundären Stoffwechselprozessen von Archaeen und Bakterien ^fungiert1,2. _F420 ist ein 5-Deazaflavin und strukturell flavin ähnlich, wobei seine chemischen und biologischen Eigenschaften eher mit denen von NAD+ oder ^NADP+ vergleichbar sind. Aufgrund der Substitution von Stickstoff durch Kohlenstoff an Position 5 des Isoalloxazinrings ist es ein starkes Reduktionsmittel und weist somit ein geringes Standard-Redoxpotential von -340 ^mV1,3 auf. _F420 besteht aus einem 5-Deazaflavin-Ring und einem 2-Phospho-L-Lactat-Linker (_F420-0). Ein Oligoglutamatschwanz, der n+1 Glutamatmonomere enthält, kann an das Molekül (_F420-n+1)⁴ gebunden sein.

Lange Zeit wurde der Cofaktor _F420 ausschließlich mit Archaeen und Actinobakterien in Verbindung gebracht. Dies wurde weitgehend rückgängig gemacht. Jüngste Analysen ergaben, dass _F420 auf verschiedene anaerobe und aerobe Organismen der Phyla Proteobakterien, Chloroflexi und möglicherweise Firmicutes verteilt ist, die eine Vielzahl von Lebensräumen wie Böden, Seen und den menschlichen Darm bewohnen1,5. Im Jahr 2019 zeigten Braga et ^al.6, dass das Proteobakterium Paraburkholderia rhizoxinica ein einzigartiges _F420-Derivat produziert, das ein 3-Phosphoglycerat anstelle eines 2-Phospholactat-Schwanzes enthält, das in verschiedenen Lebensräumen weit verbreitet sein könnte. Innerhalb der Domäne Archaea wurde _F420 in mehreren Linien gefunden, darunter methanogenic7, methanotrophic8,9 und sulfatreduzierende ^Ordnungen10, und soll in Thaumarchaeota11 hergestellt werden. _F420 ist am besten als essentielles Redox-Coenzym in der hydrogenotrophen und methylotrophen Methanogenese bekannt. Die reduzierte Form von _F420 (_F420H2) fungiert als Elektronendonor zur Reduktion von Methylentetrahydromethanopterin (Methylen-H4MPT, Mer) und Methenyl-H4MPT12,13. Es kann auch als Elektronenträger in _{H2-unabhängigen} Elektronentransportwegen von Methanogenen verwendet werden, die Cytochrome ^{enthalten12,14}. Darüber hinaus weist die oxidierte Form von _F420 eine charakteristische blau-grüne Fluoreszenz bei Anregung bei 420 nm auf, die den mikroskopischen Nachweis von Methanogenen erleichtert (Abbildung 1). Aufgrund seines geringen Redoxpotentials erleichtert _F420 (i) die exogene Reduktion eines breiten Spektrums von ansonsten widerspenstigen oder toxischen organischen Verbindungen, (ii) die Synthese von Tetracyclin- und Lincosamid-Antibiotika oder Phytotoxinen in Streptomyceten (Stamm-Actinobakterien) und (iii) die Resistenz gegen oxidativen oder nitrosativen Stress oder andere ungünstige Bedingungen in Mykobakterien (Stamm-Actinobakterien)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Folglich sind _{F420-abhängige} Oxidoreduktasen vielversprechende Biokatalysatoren für industrielle und pharmazeutische Zwecke sowie für die Bioremediation kontaminierter ^{Umgebungen1,23}. Trotz dieser jüngsten Erkenntnisse sind die genauen Rollen des Cofaktors _F420 bei Actinobakterien oder anderen Bakterienstämmen noch marginal bekannt.

Es gibt mindestens drei Wege für die F420-Biosynthese2,6,24. Zu Beginn wird der Biosyntheseweg in eine 5-Deazaflavin-Biosynthese und einen 2-Phospholactat-Stoffwechselzweig aufgeteilt. Der reaktive Teil des _{F420-Moleküls} wird über _FO-Synthase unter Verwendung der Substrate Tyrosin und 5-Amino-6-Ribitylamino-2,4(1H,3H)-pyrimidindion synthetisiert. Das Ergebnis ist das Riboflavin-Level-Chromophor _FO. Innerhalb des derzeit akzeptierten Laktatstoffwechselzweigs wird L-Laktat durch eine L-Laktatkinase (CofB) zu 2-Phospho-L-Lactat phosphoryliert; 2-Phospho-L-lactat wiederum wird durch 2-Phospho-L-Lactat-Guanylyltransferase (CofC) zu L-Lactyl-2-diphospho-5′-guanosin guanyliert. Im nächsten Schritt wird L-Lactyl-2-diphospho-5′-guanosin durch eine 2-Phospho-L-Lactat-Transferase (CofD) mit _FO zu _F420-02 verknüpft. Schließlich ligat das Enzym _F420-0:ɣ-Glutamylligase (CofE) Glutamatmonomere zu _F420-0 und bildet den endgültigen ^Cofaktor6 in unterschiedlicher ^Anzahl23,25. Verschiedene Organismen zeigen unterschiedliche Muster in der Anzahl der angehängten Glutamatrückstände, wobei kürzere Schwänze für Methanogene gefunden wurden als in Mykobakterien2,25,26. Im Allgemeinen zeigen Methanogene Schwanzlängen von zwei bis drei, mit bis zu fünf im acetoklastischen Methanogen Methanosarcina sp., während die Schwanzlängen in Mycobacterium sp. zwischen fünf und sieben Glutamatresten lagen2,25,26,27. Neuere Erkenntnisse zeigten jedoch, dass langkettiges _F420 an _{F420-abhängige} Oxidoreduktasen mit einer höheren Affinität bindet als kurzkettiges _F420; Darüber hinaus erhöht gebundenes langkettiges _F420 die Substrataffinität, verringert aber die Fluktuationsrate der jeweiligen ^Enzyme23.

Der Nachweis des Cofaktors _F420 basiert oft auf seiner Fluoreszenz. Dabei wurden seine Oligoglutamatderivate mittels Reversed-Phase (RP)-^HPLC27,28 getrennt. Kürzlich verwendeten Ney et al. Tetrabutylammoniumhydroxid als Ionenpaarungsreagenz für den negativ geladenen Glutamatschwanz, um die Trennung auf RP-HLPC erfolgreich zu ^verbessern5. Hier stellen wir eine Methode zur Probenvorbereitung, anschließenden Lyse, Extraktion, Reinigung, Trennung und Quantifizierung des Cofaktors _F420 nicht nur aus Reinkulturen, sondern auch aus verschiedenen Umweltproben (d.h. Böden und Faulschlamm) vor.