Extractie van cofactor _F420 voor analyse van polyglutamaatstaartlengte uit methanogene zuivere culturen en milieumonsters

_F420 is een wijdverspreide maar vaak verwaarloosde cofactor, die functioneert als een obligate twee-elektron hydride drager in primaire en secundaire metabolische processen van zowel Archaea als ^{Bacteriën1,2}. _F420 is een 5-deazaflavin en structureel vergelijkbaar met flavinen, waarbij de chemische en biologische eigenschappen meer vergelijkbaar zijn met die van NAD⁺ of NADP⁺. Door de vervanging van stikstof door koolstof op positie 5 van de isoalloxazinering is het een sterk reductiemiddel, waardoor het een lage standaard redoxpotentiaal van -340 ^mV1,3 vertoont. _F420 bestaat uit een 5-deazaflavin ring en een 2-fosfo-L-lactaat linker (_F420-0). Een oligoglutamaatstaart met n+1 glutamaatmonomeren kan aan het molecuul worden bevestigd (_F420-n+1)⁴.

Lange tijd is de cofactor _F420 uitsluitend geassocieerd met Archaea en Actinobacteriën. Dit is grotendeels ongedaan gemaakt. Recente analyses onthulden dat _F420 wordt verdeeld over diverse anaerobe en aerobe organismen van de phyla Proteobacteria, Chloroflexi en mogelijk Firmicutes die een groot aantal habitats bewonen, zoals bodems, meren en de menselijke ^darm1,5. In 2019 toonden Braga et ^al.6 aan dat de proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica een uniek _{F420-derivaat} produceert, met een 3-fosfoglyceraat in plaats van een 2-fosfosfataalstaart, die wijdverspreid kan zijn in verschillende habitats. Binnen het domein Archaea is _F420 gevonden in verschillende afstammingslijnen, waaronder methanogene7, methanotrofe8,9 en sulfaatreducerende ^orders10, en wordt verondersteld te worden geproduceerd in Thaumarchaeota11. _F420 is vooral bekend als een essentieel redoxco-enzym in hydrogenotrofe en methylotrofe methanogenese. De gereduceerde vorm van _F420 (_F420H2) functioneert als elektronendonor voor de reductie van methyleentetrahydromethanopterine (methyleen-H4MPT, Mer) en methenyl-H4MPT12,13. Het kan ook worden gebruikt als elektronendrager in _{H2-onafhankelijke} elektronentransportroutes van methanogenen die cytochromen ^{bevatten12,14}. Bovendien heeft de geoxideerde vorm van _F420 een karakteristieke blauwgroene fluorescentie bij excitatie bij excitatie bij 420 nm, wat de detectie van methanogenen microscopisch vergemakkelijkt (figuur 1). Vanwege het lage redoxpotentieel vergemakkelijkt _F420 (i) de exogene reductie van een breed spectrum van anderszins recalcitrante of toxische organische verbindingen, (ii) synthese van tetracycline en lincosamide antibiotica of fytotoxinen in streptomyceten (fylum Actinobacteriën), en (iii) resistentie tegen oxidatieve of nitrosatieve stress of andere ongunstige omstandigheden in mycobacteriën (fylum Actinobacteriën)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Bijgevolg zijn _{F420-afhankelijke} oxidoreductasen veelbelovende biokatalysatoren voor industriële en farmaceutische doeleinden en voor bioremediatie van verontreinigde ^{omgevingen1,23}. Ondanks deze recente bevindingen zijn de exacte rollen van de cofactor _F420 nog steeds marginaal bekend in Actinobacteriën of andere bacteriële phyla.

Er zijn ten minste drie routes voor F420-biosynthese2,6,24. In het begin wordt de biosyntheseroute opgesplitst in een 5-deazaflavin biosynthese en een 2-fosfosfataal metabolisme tak. Het reactieve deel van het _{F420-molecuul} wordt gesynthetiseerd via _FO-synthase met behulp van de substraten tyrosine en 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedion. Het resultaat is het riboflavinegehalte chromofoor _FO. Binnen de momenteel geaccepteerde lactaatmetabolismetak wordt L-lactaat gefosforyleerd tot 2-fosfo-L-lactaat door een L-lactaatkinase (CofB); 2-fosfo-L-lactaat wordt op zijn beurt ge guanyleerd tot L-lactyl-2-difosfo-5′-guanosine door 2-fosfo-L-lactaat guanylyltransferase (CofC). In de volgende stap wordt L-lactyl-2-difosfo-5′-guanosine gekoppeld aan _FO door een 2-fosfo-L-lactaattransferase (CofD) om _F420-02 te vormen. Ten slotte ligeert het enzym _F420-0:ɣ-glutamylligase (CofE) glutamaatmonomeren tot _F420-0 en vormt het de uiteindelijke ^cofactor6 in verschillende ^{aantallen23,25}. Verschillende organismen vertonen verschillende patronen in het aantal aangehechte glutamaatresiduen, met kortere staarten gevonden voor methanogenen dan in mycobacteriën2,25,26. Over het algemeen vertonen methanogenen staartlengtes van twee tot drie, met maximaal vijf in het acetoclastische methanogeen, Methanosarcina sp., terwijl de staartlengtes in Mycobacterium sp. varieerden van vijf tot zeven glutamaatresiduen2,25,26,27. Recente bevindingen toonden echter aan dat _F420 met lange keten bindt aan _{F420-afhankelijke} oxidoreductasen met een hogere affiniteit dan _F420 met een korte keten; bovendien verhoogt gebonden lange-keten _F420 de substraataffiniteit, maar verlaagt de omloopsnelheid van de respectieve ^enzymen23.

Detectie van cofactor _F420 is vaak gebaseerd op de fluorescentie. Daarbij werden de oligoglutamaatderivaten gescheiden met behulp van omgekeerde fase (RP)-^HPLC27,28. Onlangs gebruikten Ney et al. tetrabutylammoniumhydroxide als een ion-parend reagens voor de negatief geladen glutamaatstaart om de scheiding op RP-HLPC met succes te ^verbeteren5. Hier presenteren we een methode voor de bereiding van monsters, daaropvolgende lysis, extractie, zuivering, scheiding en kwantificering van cofactor _F420, niet alleen uit zuivere culturen, maar ook uit verschillende milieumonsters (d.w.z. bodems en vergisterslib).