استخراج _F420 عامل مساعد لتحليل طول ذيل Polyglutamate من الثقافات النقية الميثانوجينية والعينات البيئية

_F420 هو عامل مساعد واسع الانتشار ولكنه مهمل في كثير من الأحيان ، والذي يعمل كحامل هيدريد إلكترونين ملزم في عمليات التمثيل الغذائي الأولية والثانوية لكل من Archaea و Bacteria1^،2. _F420 هو 5-deazaflavin ويشبه هيكليا فلافينس، حيث خصائصه الكيميائية والبيولوجية هي أكثر قابلية للمقارنة مع تلك التي NAD ⁺ أو NADP ⁺. بسبب استبدال النيتروجين مع الكربون في موقف 5 من حلقة ايزالوكسازين، بل هو اختزال قوي، وبالتالي تظهر إمكانات الأكسدة القياسية منخفضة من -340 ^mV1،3. _F420 يتكون من حلقة 5-deazaflavin و2-فوسفو-L-لاكتات رابط (_F420-0). يمكن إرفاق ذيل oligoglutamate الذي يحتوي على مونومرات الغلوتامات n+1 بالجزيء (_F420-n+1)⁴.

لفترة طويلة، ارتبط العامل المساعد _F420 فقط مع Archaea وActinobacteria. وقد انقلب هذا إلى حد كبير. كشفت التحليلات الحديثة أن _F420 يتم توزيعها بين الكائنات اللاهوائية والهوائية المتنوعة من فيلا بروتيوبكتيريا، كلوروفليكسي، وربما Firmicutes التي تسكن عددا لا يحصى من الموائل مثل التربة والبحيرات، والأمعاء ^{البشرية1،5}. في عام 2019 ، أظهر Braga et ^al.6 ، أن البروتيوباكتيريوم Paraburkholderia rhizoxinica ينتج مشتق _F420 فريد من نوعه ، يحتوي على 3 فوسفوغليسيرات بدلا من ذيل 2 فوسفولاكت ، والذي قد يكون واسع الانتشار في موائل مختلفة. داخل مجال Archaea، تم العثور على _F420 في عدة أنساب، بما في ذلك ميتانوجينيك7، ميتانوتروبيك8^،9، وأوامر خفض ^{الكبريتات10}، ومن المفترض أن يتم إنتاجها في Thaumarchaeota11. ومن المعروف _F420 كما انزيم الأكسدة الأساسية في هيدروجينوتروبيك والميثيلوتروبيك ميتانوجينيسيس. يعمل الشكل المنخفض من _F420 (_F420H2) كمتبرع إلكترون للحد من الميثيلينتيتراهيدروميثانوبتيرين (ميثيلين-H4MPT، مير) والميثنيل-H4MPT12,13. ويمكن أيضا أن تستخدم كناقل إلكترون في مسارات نقل الإلكترونات المستقلة _H2 من الميثانوجينات التي تحتوي على ^{السيتوكروم12,14}. وعلاوة على ذلك، فإن الشكل المؤتأكسد من _F420 له مضان أزرق وأخضر مميز عند الإثارة عند 420 نانومتر، مما يسهل الكشف عن الميثانوجينات مجهريا (الشكل 1). نظرا لانخفاض إمكانات الأكسدة ، يسهل _F420 (1) التخفيض الخارجي طيف واسع من المركبات العضوية المتمردة أو السامة ، ‘2’ تركيب المضادات الحيوية التتراسيكلين واللينكوساميد أو السموم النباتية في الستربتوميسيتات (فيلوم أكتينوباكتيريا)، و’3′ مقاومة الإجهاد التأكسدي أو النيتروزيفي أو غيرها من الظروف غير المواتية في البكتيريا الفطرية (فيلوم أكتينوباكتيريا)^1،5،15، 16,17,18,19,20,21,22. وبالتالي، تعد الاكسيدuctases المعتمدة على _F420 بالمواد الحيوية الواعدة للأغراض الصناعية والصيدلانية وكذلك للمعالجة البيولوجية للبيئات ^{الملوثة1،23}. على الرغم من هذه النتائج الأخيرة ، فإن الأدوار الدقيقة للمتبرع المساعد _F420 لا تزال معروفة بشكل هامشي في Actinobacteria أو الفيلا البكتيرية الأخرى.

هناك ما لا يقل عن ثلاثة مسارات _لF420 التمثيل ^{الحيوي2،6،24}. في البداية ، يتم تقسيم مسار التمثيل الحيوي إلى التمثيل الحيوي 5-deazaflavin وفرع التمثيل الغذائي 2-phospholactate. يتم تصنيع الجزء التفاعلي من جزيء _F420 عن طريق _FO-synthase باستخدام التيروزين الركيزة و5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H)-pyrimidinedione. والنتيجة هي مستوى الريبوفلافين كروموفور _FO. داخل فرع التمثيل الغذائي لللاكتات المقبول حاليا، L-lactate هو الفوسفور إلى 2-فوسفو-L-اللاكتات بواسطة كيناز L-لاكتات (CofB)؛ 2-فوسفو-L-لاكتات، بدوره، هو guanylated إلى L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine بواسطة 2-فوسفو-L-لاكتات جوانيليلترانسفيراز (CofC). في الخطوة التالية، يرتبط L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine إلى _FO عن طريق نقل 2-فوسفو-L-لاكتات (CofD) لتشكيل _F420-02. وأخيرا، فإن إنزيم _F420-0:ɣ-الجلوتاميل ليجاز (CofE) ليغامات مونومرات إلى _F420-0، وتشكيل المساعد ^{النهائي6} في أرقام مختلفة23^،25. تظهر الكائنات الحية المختلفة أنماطا مختلفة في عدد بقايا الغلوتامات المرفقة ، مع ذيول أقصر وجدت للميثانوجينات مما كانت عليه في البكتيريا ^{الفطرية2،25،26}. عموما، تظهر methanogens أطوال الذيل من اثنين إلى ثلاثة، مع ما يصل إلى خمسة في ميثانوجين الأسيتوكلاستيك، ميثانوساركينا sp.، في حين أن أطوال الذيل وجدت في Mycobacterium sp. تراوحت بين خمسة إلى سبعة بقايا الغلوتامات2^،25،26،27. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن سلسلة طويلة _F420 يربط إلى oxidoreductases _F420 تعتمد مع تقارب أعلى من _F420 سلسلة قصيرة؛ وعلاوة على ذلك، ملزمة سلسلة طويلة _F420 يزيد من تقارب الركيزة ولكن يقلل من معدل دوران الإنزيمات ^{المعنية23}.

غالبا ما يعتمد الكشف عن _F420 المساعد على مضانه. وبالتالي، تم فصل مشتقات الغلوتامات الأوليغو باستخدام المرحلة المعكوسة (RP) –^HPLC27,28. في الآونة الأخيرة، استخدم Ney وآخرون هيدروكسيد رباعي البوتيلامونيوم ككواشف اقتران أيون لذيل الغلوتامات المشحون سلبيا لتعزيز الفصل على RP-HLPC ^بنجاح5. هنا، نقدم طريقة لإعداد العينات، وتحلل لاحق، واستخراج، وتنقية، وفصل، وتكميم _F420 عامل مساعد ليس فقط من الثقافات النقية ولكن أيضا من عينات بيئية مختلفة (أي التربة والحمأة هاضم).