Estudos de associação multi-omics em larga escala (Mo-GWAS): Diretrizes para preparação e normalização de amostras

1. Design experimental e cultivo de plantas NOTA: Configurar o experimento dependendo da hipótese experimental, por exemplo, o uso de uma população gwas em larga escala diminui a necessidade de múltiplas réplicas, uma vez que os testes estatísticos serão realizados com base nos hapltipos de todos os SNPs individuais em vez da adesão. Em contraste, múltiplas réplicas são indispensáveis em outras abordagens experimentais. Os seguintes pontos devem ser considerados durante a preparação do experimento. Inclua réplicas biológicas suficientes, dependendo da hipótese experimental. Randomizar as réplicas biológicas em termos de blocos para reduzir o viés ambiental local durante o cultivo, por exemplo, estufa, campo. Garanta a manutenção adequada da planta durante o crescimento. Trate as plantas de forma homogênea para reduzir o viés. 2. Preparação de material vegetal biológico Preparação da colheita Tubos de colheita de rótulos (20 mL) contendo duas contas metálicas de 5 mm e 2 mm de diâmetro para homogeneização. Encha uma de guerra com nitrogênio líquido.NOTA: As plantas devem estar em fase vegetativa para colheita de folhas frescas e tecidos radiculares. Colher amostras biológicas por congelamento de flash em nitrogênio líquido. Colheita o mais rápido possível para excluir a influência da oscilação circadiana no metabolismo durante as durações de colheita prolongadas12,13. Armazene a folha fresca colhida e os tecidos radiculares para posterior processamento a -80 °C.NOTA: O corte de folhas para o congelamento de flashs não deve demorar mais do que alguns segundos, pois após o decote da folha, os processos biológicos ativos alterariam os perfis metabólicos devido à ferida. Para as raízes, pré-limpar as raízes lavando com água antes de congelar em nitrogênio líquido. O excesso de água na superfície raiz deve ser absorvido com tecido de papel. As sementes secas podem ser armazenadas à temperatura ambiente; não é necessário congelamento de nitrogênio líquido. Triture o tecido usando um moinho de mistura de tecidos. Pré-consulte os suportes de tubos em nitrogênio líquido por alguns minutos para manter uma baixa temperatura enquanto moe o tecido. Transporte as amostras biológicas em uma de guerra contendo nitrogênio depois de tirá-las do congelador -80 °C. Moer os tecidos para obter pó homogêneo; use 25 Hz por 1 min e repita após o congelamento em nitrogênio líquido se o tecido não for homogêneo. Para moer as sementes secas, coloque as sementes em um pote de moagem com uma conta metálica de 15 mm de diâmetro. Use a mesma frequência e tempo mencionados em 2.3.3.NOTA: Argamassas e pilões limpos e pré-cozidos podem ser usados se um moinho de mistura de tecidos não estiver disponível. Pré-lo rotulados tubos de microcentrifuge de bloqueio seguro de 2 mL. Pesar 50 mgs com um erro de ±5 mg de material vegetal fresco usando uma escala analítica. Pré-preparar as ferramentas utilizadas para a transferência de material vegetal em nitrogênio líquido. Certifique-se de que o material vegetal permaneça congelado durante o processo de pesagem.NOTA: Não exponha material fresco da planta muito tempo à temperatura ambiente, pois os processos biológicos são ativados pelo aumento da temperatura, alterando os perfis metabólicos14. Gerar amostras adicionais de controle de qualidade (QC) agrupando uma proporção de cada amostra e pesando 50 mgs com um erro de ±5 mg de material vegetal fresco agrupado em tubos de microcentrifus de bloqueio seguro pré-cozidos de 2 mL.NOTA: Pelo menos três amostras de QC são aconselhadas para cada 60 amostras. As amostras de QC são essenciais para a correção a jusante, normalização e análises. 3. Reagentes de extração Tecido fresco, por exemplo, folhas e raízesNOTA: A extração da amostra é baseada em um protocolo descrito anteriormente15. Este protocolo foi modificado com base nas necessidades atuais, por exemplo, múltiplos tecidos, diferentes padrões internos e experimentos em larga escala. Além disso, todos os volumes e configurações de instrumentos mencionados abaixo são ajustados para unidades analíticas internas. Os usuários do protocolo devem ajustá-los de acordo com sua unidade analítica e amostras biológicas, com base em amostras de teste. Mistura de extração 1 (EM1): éter de tert-butil de metila (MTBE)/metanol (MeOH) (3:1 v/v) Prepare uma mistura de MTBE/MeOH em uma proporção de 3:1. Para 100 mL de solvente de extração, misture 75 mL de MTBE com 25 mL de MeOH em uma garrafa de vidro limpa.NOTA: Os solventes devem ser manuseados cuidadosamente no capô da fumaça com equipamentos de segurança adequados. Adicione 45 μL de 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholina (1 mg/mL em clorofórmio) como padrão interno para a análise lipídica baseada em UHPLC-MS, 400 μL de ribitol (1 mg/mL na água) como padrão interno para a análise baseada em GC-MS, e 125 μL de isovitexina (1 mg/mL em MeOH/água (1:1 v/v)) para análise metabólica baseada em UHPLC-MS.NOTA: A adição de normas internas é necessária para a normalização pós-análise de acordo com as necessidades analíticas. Como 1 mL de EM1 é necessário para cada amostra, prepare uma solução de estoque de acordo com o tamanho experimental da amostra, que deve ser usada para todo o experimento. O EM1 deve ser armazenado a -20 °C. Verifique a ausência do padrão interno utilizado e sobreposição com outros compostos das espécies investigadas. Vários padrões podem ser usados; a seleção das normas internas neste protocolo foi baseada em testes anteriores utilizando extratos comuns de feijão16. Mistura de extração 2 (EM2) água/metanol (MeOH) (3:1 v/v) Para 100 mL EM2, adicione 75 mL de água dupla destilada e 25 mL de MeOH em uma garrafa de vidro limpa. Adicione 500 μL de EM2 por amostra e prepare uma solução de estoque de acordo com o tamanho experimental da amostra, que deve ser usada para todo o experimento. Armazene o EM2 a 4 °C. Sementes secas Mistura de extração 3 (EM3) metanol (MeOH)/ água (7:3 v/v) Para 100 mL de EM3, adicione 70 mL de MeOH e 30 mL de água duplamente destilada em uma garrafa de vidro limpa. Prepare 1 mL de EM3 para cada amostra. Adicione 400 μL de ribitol (1 mg/mL na água) como padrões internos para a análise baseada em GC-MS e 125 μL de Isovitexin (1 mg/mL em MeOH/água (1:1 v/v)) para análise metabólica baseada em UHPLC-MS.NOTA: Prepare uma solução de estoque de acordo com o tamanho da amostra experimental e use-a para todo o experimento. Armazene o EM3 a 4 °C. 4. Extração da amostra Tecido fresco, por exemplo, folhas e raízes Prepare três tubos de microcentrifus de bloqueio seguro de 1,5 mL para cada amostra. Mantenha o EM1 em um sistema de resfriamento líquido de -20 °C. Transfira as amostras frescas do congelador -80 °C para gelo seco ou nitrogênio líquido para transporte. Adicione 1 mL de EM1 pré-cozido a cada alíquota de 50 mg e vórtice brevemente antes de manter no gelo. Incubar as amostras em um agitador orbital a 800 × g por 10 min a 4 °C. Sonicate as amostras em um banho de sônica resfriado no gelo por 10 minutos. Adicione 500 μL de EM2 usando uma pipeta multicanal para evitar variação nos volumes adicionados. Vórtice as amostras brevemente para misturar as misturas de extração antes de centrifugar a 11.200 × g por 5 min a 4 °C. Após a separação de fase, transfira 500 μL da fase superior contendo lipídios para um tubo de microcentrifuge de bloqueio seguro de 1,5 mL pré-rotulado. Remova o resto da fase superior.NOTA: Tome cuidado durante a transferência, pois esta fase superior tem uma alta pressão de vapor e tende a vazar da pipeta. Transfira 150 μL e 300 μL das fases inferiores de metabólica polar e semipolar em dois tubos de microcentrifuuge de bloqueio seguro de 1,5 mL utilizados para análise de GC-MS e UHPLC-MS, respectivamente. Concentre todas as frações extraídas deixando os solventes evaporarem sem aquecimento usando um concentrador de vácuo e armazenar a -80 °C. Sementes secas Prepare dois tubos de microcentrifus de bloqueio seguro de 1,5 mL para cada amostra. Mantenha o EM3 no gelo. Coloque uma conta metálica de 5 mm de diâmetro nas alíquotas da amostra. Adicione 1 mL de EM3 em cada alíquota de 50 mg e homogeneize as amostras a 25 Hz por 2-3 minutos antes de colocá-las no gelo. Sonicate as amostras em um banho de sônica resfriado no gelo por 10 minutos. Vórtice as amostras brevemente antes de centrifugar a 11.200 × g por 5 min a 4 °C. Transfira 150 μL e 300 μL do supernante em dois tubos de microcentrifuge de bloqueio seguro de 1,5 mL utilizados para análise de GC-MS e UHPLC-MS, respectivamente. Concentre todas as frações extraídas deixando os solventes evaporarem sem aquecimento usando um concentrador de vácuo e armazenar a -80 °C.NOTA: Com base na experiência, os usuários são aconselhados a executar a etapa 4.2 para metabólitos semipolares e análise metabólito derivatizada em sementes secas. Realizar a etapa de extração 4.1 para análise lipídica de sementes secas. 5. Análise de lipídios utilizando UHPLC-MS Suspenda novamente as frações lipídicas secas em 250 μL de acetonitrilo:2-propanol (7:3, vol/vol). Sonicar a fase lipídica por 5 min, centrífuga a 11.200 × g por 1 min. Transfira 90 μL do supernante para um frasco de vidro para LC-MS. Injete 2 μL dos extratos no LC-MS. Realize o fracionamento lipídeto em uma coluna C8 de fase invertida realizada a 60 °C com um fluxo de 400 μL/min com alterações graduais de eluent A e B, como mostrado na Tabela 1. Adquira o espectro de massa no modo de ionização positiva com uma faixa de massa de 150-1.500 m/z. Inclua várias amostras de QC em todos os lotes diários e um branco para garantir a correção para variação analítica. Randomize amostras em termos de bloco em ordem sequencial. 6. Análise de metabólitos polares e semipolares utilizando UHPLC-MS Suspenda a fase polar seca em 180 μL de metanol de grau UHPLC: água (1:1 v/v). Sonicar a fase polar por 2 min, centrífuga a 11.200 × g por 1 min. Transfira 90 μL do supernante para um frasco de vidro para LC-MS. Injete 3 μL dos extratos no LC-MS. Realize o fracionamento metabólico em uma coluna de fase C18 invertida realizada a 40 °C com um fluxo de 400 μL/min com alterações graduais de eluent A e B, como mostrado na Tabela 1. Adquira o espectro de massa em uma faixa de massa de 100-1.500 m/z em uma varredura completa de MS e toda a fragmentação de íons (AIF) induzida por dissociação collisional de alta energia (HCD) de 40 keV.NOTA: Use ambos os modos de ionização. No entanto, devido à capacidade limitada durante a execução de um grande número de amostras, execute amostras de teste em ambos os modos de ionização para determinar o modo de ionização preferido. Inclua várias amostras de QC em todos os lotes diários e um branco para garantir a correção para variação analítica. Randomize amostras em termos de bloco em ordem sequencial. Execute um QC agrupado em MS2 dependente de dados nos modos de ionização negativa e positiva. Use o espectro de massa obtido em um passo posterior (8.5) para anotação. 7. Análise de Metabólitos derivatizados utilizando GC-MS17,18 NOTA: A análise dos metabólitos derivatizados baseia-se em um protocolo descrito anteriormente17. Manuseie todos os reagentes de derivatização no capô da fumaça. Certifique-se de que n-metil-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamida (MSTFA) não entre em contato com água e umidade. Reagente de derivatização 1 (DR1) Dissolver o cloridrato de metoximina na piridina para obter uma concentração de 30 mg/mL de DR1. Use 40 μL de DR1 para cada amostra. Prepare uma solução de estoque de acordo com o tamanho da amostra e armazene à temperatura ambiente. Reagente de derivação 2 (DR2) Dissolver mSTFA com 20 μL de ésteres de metila de ácido graxo (FAMEs) por 1 mL de MSTFA. Use 70 μL de DR2 para cada amostra. Prepare uma solução de estoque de acordo com o tamanho da amostra. Armazene MSTFA a 4 °C e os FAMEs a -20 °C.NOTA: Os FAMEs incluem metilcaprylato, metil pelargonato, metilcapato, metillaurate, metilmíricoto, metilpalmitato, metilsteato, metileicosanoato, metildocosanoato, ester de metila de ácido lignocerico, metilhexacosanoato, metiloctacosanoato e metilester ácido triatênico, que são dissolvidos no CHCl3 a uma concentração de 0,8 μL/mL ou 0,4 mg/mL para padrões líquidos ou sólidos, respectivamente. Resseque a pelota da fase polar (armazenada a -80 °C) usando um concentrador de vácuo por 30 minutos para evitar qualquer interferência de H2O originária durante o armazenamento com os solventes utilizados para a derivatização a jusante. Adicione 40 μL de DR1. Agite as amostras a 950 × g por 2 h a 37 °C usando um agitador orbital, seguido por um curto spin-down do líquido. Adicione 70 μL de DR2. Agite novamente a 950 × g por 30 min a 37 °C usando um agitador orbital. Centrifugar brevemente à temperatura ambiente antes de transferir 90 μL em frascos de vidro para análise GC-MS. Injete 1 μL no modo splitless GC-MS, dependendo das concentrações metabólitos, com um fluxo constante de gás portador de hélio de 2 mL/min. A temperatura da injeção é definida para 230 °C usando uma coluna capilar MDN-35 de 30 m.NOTA: Informações adicionais, por exemplo, gradiente de temperatura, podem ser encontradas na Tabela 1. A faixa de massa está definida para 70-600 m/z com 20 scans/min. Inclua modos divididos para permitir a quantificação de compostos de sobrecarga putativa, economia de custos e tempo para extração de revasação nesses casos. Inclua várias amostras de QC em todos os lotes diários e um branco para garantir a correção para variação analítica. Randomize amostras adequadamente bloqueadas em ordem sequencial. 8. Processamento de cromatograma e anotação composta Filtrar o ruído químico definindo limiares de intensidade. Inclua todas as amostras de QC durante o processamento dos cromatógrafos.NOTA: Para dados em larga escala, a filtragem de ruído é crucial para diminuir o tempo de computação e o poder de processamento. Alinhe os cromatógrafos definindo uma janela de mudança de tempo de retenção. Verifique os cromatogramas de cada lote para avaliar a variação intra e entre lotes. Realize a detecção de pico dependendo da forma de pico, por exemplo, altura e largura para a largura total a cálculos meia-máximo (FWHM). Isótopos de cluster para reduzir sinais redundantes e filtrar singletons.NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o software utilizado para o processamento de cromatogramas. Protocolos aprofundados sobre como processar cromatógramas usando várias ferramentas de software disponíveis livremente, por exemplo, MS-DIAL, MetAlign, MzMine e Xcalibur 19,20,21, são fornecidos. Use os dados ddMS2 de uma amostra de QC agrupada para anotação composta. Avalie a estrutura molecular determinando a massa monoisotópica e observando perdas neutras comuns, aglycones carregados conhecidos e diferentes tipos de decotes, por exemplo, homolíticos ou heterolíticos16,22. Para relatar dados metabólitos, siga a recomendação descrita em Fernie et al. 201123.NOTA: Diferentes abordagens metabolômicas computacionais podem ser usadas para analisar dados metabolômicos 24,25,26. 9. Normalização do conjunto de dados metabolômicos em larga escala Verifique a distribuição das normas internas e normalize corrigindo a resposta de padrões internos únicos ou múltiplos. Corrija as intensidades máximas obtidas do cromatograma sobre o peso amostral exato dividindo as intensidades máximas pelo peso amostral homoter homogeneizado aliquoted a partir do passo 2.5. Corrija para a deriva de intensidade em séries multi-lote. Execute métodos de correção baseados em QC, como a suavização de dispersão localmente estimada (LOESS)27 usando R.NOTA: Várias ferramentas e pacotes estão disponíveis para atender ao desvio do desempenho do MS durante a aquisição dos lotes inteiros 28,29. Garanta a distribuição normal dos traços por transformação de dados, por exemplo, transformação Box-Cox30 usando a função boxcox () do pacote R MASS para a realização do GWAS. Realize o dimensionamento de dados, por exemplo, o dimensionamento de Pareto, para análise multivariada para garantir a pesagem adequada dos compostos de baixa abundância31.NOTA: Se possível, realize um ensaio de recuperação para evitar efeitos matriciais, por exemplo, supressão deíons 14. 10. Estudos de associação genoma (GWAS)32 Chame polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) ou variantes estruturais (SV) dos dados de sequenciamento33,34. Filtrar dados genotípicos para menor frequência de alelo (MAF) 10% para evitar viés de baixa frequência usando Tassel35. Calcule as melhores previsões lineares imparcial (BLUPs) para cada característica normalizada sobre as repetições experimentais para eliminar viés originário de fatores ambientais (efeitos aleatórios) usando o pacote R Ime436. Use BLUPs de cada recurso individualmente para executar GWAS usando o pacote rMVP em R37.NOTA: Cada recurso metabolômico é visto aqui como um fenótipo autônomo individual. Ao realizar o GWAS, corrija para a estrutura populacional usando a análise de componentes principais (PCA) e identidade por estado (IBS) ou vanRaden para minimizar os efeitos de confusão. Além disso, considere usar um modelo linear misto (MLM) ou um modelo misto multi-lócus (MLMM), pois os modelos mistos contêm efeitos fixos e aleatórios. 11. Detecção de QTL Verifique os SNPs mostrando associação significativa, levando em consideração as parcelas de Manhattan, para cálculos de desequilíbrio (LD) para determinar a região genética subjacente. Realize os cálculos de LD usando o mapa de calor LD do pacote R ou Tassel 5. Verifique os SNPs associados para saber o tamanho do efeito sobre o traço examinando os níveis de características para alterações estatísticas entre haplotipos para encontrar SNPs causais potenciais, por exemplo, SNPs levando a uma mudança de aminoácido na sequência de codificação de proteínas, o que poderia explicar a variação fenotípica.NOTA: Como as associações de traços de SNP não necessariamente produzem associação causal, é crucial determinar a região genômica. A identidade composta por anotação de características pode ajudar imensamente a encontrar os genes candidatos certos em uma região genômica específica. Sugerimos combinar todas as QTL detectadas associadas a certos compostos em um mapa pleiotrópico para sublinhar as regiões genéticas38, como mostrado na Figura 4. Para validação de genes candidatos, várias abordagens podem ser realizadas (veja a discussão).