Grootschalige multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): richtlijnen voor monstervoorbereiding en normalisatie

1. Experimenteel ontwerp en plantenteelt OPMERKING: Het opzetten van het experiment afhankelijk van de experimentele hypothese, bijvoorbeeld, het gebruik van een grootschalige GWAS-populatie vermindert de noodzaak van meerdere replicaties, omdat statistische tests zullen worden uitgevoerd op basis van de haplotypen van alle individuele SNP’s in plaats van de toetreding. Daarentegen zijn meerdere replicaties onmisbaar in andere experimentele benaderingen. Bij de voorbereiding van het experiment moet rekening worden gehouden met de volgende punten. Neem voldoende biologische replicaties op, afhankelijk van de experimentele hypothese. Randomiseer de biologische replicaties blokgewijs om lokale milieubias tijdens de teelt te verminderen, bijvoorbeeld kas, veld. Zorg voor een goed onderhoud van de plant tijdens de groei. Behandel planten homogeen om bias te verminderen. 2. Bereiding van biologisch plantaardig materiaal Oogstvoorbereiding Label oogstbuizen (20 ml) met twee metalen kralen met een diameter van 5 mm en 8 mm voor homogeniseren. Vul een dewar met vloeibare stikstof.OPMERKING: Planten moeten zich in de vegetatieve fase bevinden voor het oogsten van vers blad- en wortelweefsel. Oogst biologische monsters door flash-freezing in vloeibare stikstof. Oogst zo snel mogelijk om de invloed van circadiane oscillatie op het metabolisme tijdens langdurige oogstduur uit te sluiten 12,13. Bewaar de geoogste verse blad- en wortelweefsels voor verdere bewerking bij -80 °C.OPMERKING: Het snijden van bladeren tot flash-freezing mag niet langer dan een paar seconden duren, omdat actieve biologische processen na bladsplitsing de metabole profielen als gevolg van verwonding zouden veranderen. Voor wortels, reinig de wortels door te wassen met water voordat ze flash-bevriezing in vloeibare stikstof. Overtollig water op het worteloppervlak moet worden opgenomen met papieren zakdoekjes. Gedroogde zaden kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard; er hoeft geen vloeibare stikstof te worden ingevroren. Maal het weefsel met behulp van een weefselmixermolen. Koel de buishouders een paar minuten voor in vloeibare stikstof om een lage temperatuur te behouden tijdens het malen van het weefsel. Transporteer de biologische monsters in een stikstofhoudende dewar nadat ze uit de vriezer van -80 °C zijn gehaald. Maal de weefsels om homogeen poeder te verkrijgen; gebruik 25 Hz gedurende 1 min en herhaal dit na het invriezen in vloeibare stikstof als het weefsel niet homogeen is gemalen. Voor het malen van gedroogde zaden, plaats de zaden in een maalpot met een metalen kraal met een diameter van 15 mm. Gebruik dezelfde frequentie en tijd als vermeld in 2.3.3.OPMERKING: Schone en voorgekoelde vijzels en stampers kunnen worden gebruikt als een weefselmixermolen niet beschikbaar is. Voorkoel gelabelde 2 ml safe-lock microcentrifugebuizen. Weeg 50 mg met een fout van ±5 mg vers plantaardig materiaal af met behulp van een analytische weegschaal. Koel de gereedschappen die worden gebruikt voor het overbrengen van plantmateriaal in vloeibare stikstof voor. Zorg ervoor dat plantmateriaal bevroren blijft tijdens het weegproces.OPMERKING: Stel vers plantmateriaal niet te lang bloot aan kamertemperatuur, omdat biologische processen worden geactiveerd door de temperatuur te verhogen, waardoor metabole profielen veranderen14. Genereer aanvullende kwaliteitscontrolemonsters (QC) door een deel van elk monster te poolen en 50 mg te wegen met een fout van ±5 mg gepoold vers plantmateriaal in voorgekoelde 2 ml safe-lock microcentrifugebuizen.OPMERKING: Ten minste drie QC-monsters worden geadviseerd voor elke 60 monsters. De QC-monsters zijn essentieel voor de downstream-correctie, normalisatie en analyses. 3. Extractiereagentia Vers weefsel, bijvoorbeeld bladeren en wortelsOPMERKING: Monsterextractie is gebaseerd op een eerder beschreven protocol15. Dit protocol is aangepast op basis van de huidige behoeften, bijvoorbeeld meerdere weefsels, verschillende interne normen en grootschalige experimenten. Bovendien worden alle hieronder genoemde volumes en instrumentinstellingen aangepast aan interne analytische eenheden. Protocolgebruikers moeten deze aanpassen aan hun analytische eenheid en biologische monsters, op basis van testmonsters. Extractiemengsel 1 (EM1): methyltert-butylether (MTBE)/methanol (MeOH) (3:1 v/v) Bereid een mengsel van MTBE/MeOH in een verhouding van 3:1. Meng voor 100 ml extractieoplosmiddel 75 ml MTBE met 25 ml MeOH in een schone glazen fles.OPMERKING: Oplosmiddelen moeten zorgvuldig worden behandeld in de zuurkast met de juiste veiligheidsuitrusting. Voeg 45 μL 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (1 mg/ml in chloroform) toe als interne standaard voor de op UHPLC-MS gebaseerde lipidenanalyse, 400 μL ribitol (1 mg/ml in water) als interne standaard voor de op GC-MS gebaseerde analyse en 125 μL isovitexine (1 mg/ml in MeOH/water (1:1 v/v)) voor UHPLC-MS-gebaseerde metabolietanalyse.OPMERKING: De toevoeging van interne normen is noodzakelijk voor de normalisatie na de analyse volgens analytische behoeften. Aangezien 1 ml EM1 nodig is voor elk monster, bereidt u een stamoplossing volgens de experimentele steekproefgrootte, die voor het hele experiment moet worden gebruikt. EM1 moet worden bewaard bij -20 °C. Controleer op de afwezigheid van de gebruikte interne standaard en overlapping met andere verbindingen in de onderzochte soort. Er kunnen verschillende standaarden worden gebruikt; de selectie van de interne normen in dit protocol was gebaseerd op eerdere tests met gemeenschappelijke bonenextracten16. Extractiemengsel 2 (EM2) water/ methanol (MeOH) (3:1 v/v) Voeg voor 100 ml EM2 75 ml dubbel gedestilleerd water en 25 ml MeOH toe in een schone glazen fles. Voeg 500 μL EM2 per monster toe en bereid een stamoplossing volgens de experimentele steekproefgrootte, die voor het hele experiment moet worden gebruikt. Bewaar EM2 bij 4 °C. Gedroogde zaden Extractiemengsel 3 (EM3) methanol (MeOH)/ water (7:3 v/v) Voeg voor 100 ml EM3 70 ml MeOH en 30 ml dubbel gedestilleerd water toe in een schone glazen fles. Bereid 1 ml EM3 voor elk monster. Voeg 400 μL ribitol (1 mg/ml in water) toe als interne normen voor de op GC-MS gebaseerde analyse en 125 μL isovitexine (1 mg/ml in MeOH/water (1:1 v/v)) voor UHPLC-MS-gebaseerde metabolietanalyse.OPMERKING: Bereid een stamoplossing voor op basis van de experimentele steekproefgrootte en gebruik deze voor het hele experiment. Bewaar EM3 bij 4 °C. 4. Monster extractie Vers weefsel, bijvoorbeeld bladeren en wortels Bereid drie 1,5 ml safe-lock microcentrifugebuizen voor elk monster voor. Bewaar EM1 in een vloeistofkoelsysteem van -20 °C. Breng de verse monsters van de -80 °C vriezer over naar droogijs of vloeibare stikstof voor transport. Voeg 1 ml voorgekoelde EM1 toe aan elke 50 mg aliquot en vortex kort voordat u op ijs blijft. Incubeer de monsters op een orbitale schudder bij 800 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Soniceer de monsters in een ijsgekoeld ultrasoonapparaatbad gedurende 10 minuten. Voeg 500 μL EM2 toe met een meerkanaals pipet om variatie in toegevoegde volumes te voorkomen. Vortex de monsters kort om de extractiemengsels te mengen voordat ze worden gecentrifugeerd bij 11.200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Nadat fasescheiding is opgetreden, brengt u 500 μL van de bovenste lipidebevattende fase over naar een vooraf gelabelde 1,5 ml safe-lock microcentrifugebuis. Verwijder de rest van de bovenste fase.OPMERKING: Wees voorzichtig tijdens het overbrengen, want deze bovenste fase heeft een hoge dampdruk en heeft de neiging om uit de pipet te lekken. Breng 150 μL en 300 μL van de lagere polaire en semipolaire metabolietbevattende fasen over in twee 1,5 ml safe-lock microcentrifugebuizen die worden gebruikt voor respectievelijk GC-MS- en UHPLC-MS-analyse. Concentreer alle geëxtraheerde fracties door de oplosmiddelen te laten verdampen zonder verhitting met behulp van een vacuümconcentrator en bewaar bij -80 °C. Gedroogde zaden Bereid twee 1,5 ml safe-lock microcentrifugebuizen voor elk monster voor. Houd EM3 op ijs. Plaats een metalen kraal met een diameter van 5 mm in de aliquots van het monster. Voeg 1 ml EM3 toe aan elke 50 mg aliquot en homogeniseer de monsters op 25 Hz gedurende 2-3 minuten voordat je ze in de ijskast zet. Soniceer de monsters in een ijsgekoeld ultrasoonapparaatbad gedurende 10 minuten. Vortex de monsters kort voordat ze worden gecentrifugeerd bij 11.200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng 150 μL en 300 μL van het supernatant over in twee 1,5 ml safe-lock microcentrifugebuizen die worden gebruikt voor respectievelijk GC-MS- en UHPLC-MS-analyse. Concentreer alle geëxtraheerde fracties door de oplosmiddelen te laten verdampen zonder verhitting met behulp van een vacuümconcentrator en bewaar bij -80 °C.OPMERKING: Op basis van ervaring wordt gebruikers geadviseerd om stap 4.2 uit te voeren voor semipolaire metabolieten en gederivatiseerde metabolietanalyse in gedroogde zaden. Voer extractiestap 4.1 uit voor lipidenanalyse van gedroogd zaad. 5. Analyse van lipiden met behulp van UHPLC-MS Suspensie de gedroogde lipidefracties opnieuw in 250 μL acetonitril:2-propanol (7:3, vol/vol). Sonicateer de lipidefase gedurende 5 minuten, centrifugeer op 11.200 × g gedurende 1 min. Breng 90 μL van het supernatant over in een glazen injectieflacon voor LC-MS. Injecteer 2 μL van de extracten in de LC-MS. Voer lipidedacctionering uit op een omgekeerde fase C8-kolom op 60 °C met een stroom van 400 μL/min met geleidelijke veranderingen van eluent A en B zoals weergegeven in tabel 1. Verkrijg de massaspectra in positieve ionisatiemodus met een massabereik van 150-1.500 m/z. Neem verschillende QC-monsters op in alle dagelijkse batches en een blanco om correctie voor analytische variatie te garanderen. Randomiseer monsters blokgewijs in opeenvolgende volgorde. 6. Analyse van polaire en semipolaire metabolieten met behulp van UHPLC-MS De gedroogde polaire fase opnieuw suspensie in 180 μL UHPLC-methanol: water (1:1 v/v). Soniceer de polaire fase gedurende 2 min, centrifugeer op 11.200 × g gedurende 1 min. Breng 90 μL van het supernatant over in een glazen injectieflacon voor LC-MS. Injecteer 3 μL van de extracten in de LC-MS. Voer metabolietfractionering uit op een omgekeerde fase C18-kolom op 40 °C met een stroom van 400 μL/min met geleidelijke veranderingen van eluent A en B zoals weergegeven in tabel 1. Verkrijg de massaspectra in een massabereik van 100-1.500 m/z in een volledige MS-scan en alle ionfragmentatie (AIF) geïnduceerd door hoogenergetische botsingsdissociatie (HCD) van 40 keV.OPMERKING: Gebruik beide ionisatiemodi. Vanwege de beperkte capaciteit tijdens het uitvoeren van grote aantallen monsters, voert u echter testmonsters uit in beide ionisatiemodi om de gewenste ionisatiemodus te bepalen. Neem verschillende QC-monsters op in alle dagelijkse batches en een blanco om correctie voor analytische variatie te garanderen. Randomiseer monsters blokgewijs in opeenvolgende volgorde. Voer een gepoolde QC uit in gegevensafhankelijke MS2 in zowel negatieve als positieve ionisatiemodi. Gebruik de verkregen massaspectra in een latere stap (8.5) voor annotatie. 7. Analyse van gederivatiseerde metabolieten met behulp van GC-MS 17,18 OPMERKING: De analyse van gederivatiseerde metabolieten is gebaseerd op een eerder beschreven protocol17. Behandel alle derivatisatiereagentia in de zuurkast. Zorg ervoor dat N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamide (MSTFA) niet in contact komt met water en vochtigheid. Derivatisatiereagens 1 (DR1) Los methoxyaminehydrochloride op in pyridine om een concentratie van 30 mg/ml DR1 te verkrijgen. Gebruik 40 μL DR1 voor elk monster. Bereid een voorraadoplossing op basis van de monstergrootte en bewaar bij kamertemperatuur. Derivatisatiereagens 2 (DR2) Los MSTFA op met 20 μL vetzuurmethylesters (FAME’s) per 1 ml MSTFA. Gebruik 70 μL DR2 voor elk monster. Bereid een voorraadoplossing op basis van de steekproefgrootte. Bewaar MSTFA bij 4 °C en de FAME’s bij -20 °C.OPMERKING: FAME’s omvatten methylcaprylaat, methylpelargonaat, methylcapraat, methyllauraat, methylmyristaat, methylpalmitaat, methylstearaat, methyleicosanoaat, methyldocosanoaat, lignocerinezuurmethylester, methylhexacosanoaat, methyloctacosanoaat en triataanzuurmethylester, die zijn opgelost in CHCl3 in een concentratie van respectievelijk 0,8 μL / ml of 0, 4 mg / ml voor vloeibare of vaste normen. Droog de pellet opnieuw uit de polaire fase (bewaard bij -80 °C) met behulp van een vacuümconcentrator gedurende 30 minuten om interferentie van H2O tijdens de opslag met de oplosmiddelen die worden gebruikt voor de downstream derivatisatie te voorkomen. Voeg 40 μL DR1 toe. Schud de monsters op 950 × g gedurende 2 uur bij 37 °C met behulp van een orbitale schudder, gevolgd door een korte spin-down van de vloeistof. Voeg 70 μL DR2 toe. Schud opnieuw op 950 × g gedurende 30 minuten bij 37 °C met behulp van een orbitale schudder. Centrifugeer kort bij kamertemperatuur voordat u 90 μL overbrengt in glazen injectieflacons voor GC-MS-analyse. Injecteer 1 μL in de splitless modus van GC-MS, afhankelijk van de metabolietconcentraties, met een constante heliumdragergasstroom van 2 ml/min. De injectietemperatuur wordt ingesteld op 230 °C met behulp van een MDN-35 capillaire kolom van 30 m.OPMERKING: Aanvullende informatie, bijvoorbeeld temperatuurgradiënt, is te vinden in tabel 1. Het massabereik is ingesteld op 70-600 m/z met 20 scans/min. Neem gesplitste modi op om de kwantificering van vermeende overbelastingsverbindingen mogelijk te maken, waardoor kosten en tijd worden bespaard voor re-derivatisatie van extracten in dergelijke gevallen. Neem verschillende QC-monsters op in alle dagelijkse batches en een blanco om correctie voor analytische variatie te garanderen. Randomiseer monsters goed blokgewijs in opeenvolgende volgorde. 8. Chromatogramverwerking en samengestelde annotatie Filter chemische ruis door intensiteitsdrempels te definiëren. Neem alle QC-monsters op tijdens het verwerken van de chromatogrammen.OPMERKING: Voor grootschalige gegevens is ruisfiltering cruciaal om de computertijd en verwerkingskracht te verminderen. Lijn de chromatogrammen uit door een retentietijdverschuivingsvenster te definiëren. Controleer de chromatogrammen van elke batch om de intra- en inter-batch variatie te beoordelen. Voer piekdetectie uit afhankelijk van de piekvorm, bijvoorbeeld hoogte en breedte voor volledige breedte bij half-maximum (FWHM) berekeningen. Clusterisotopen om redundante signalen te verminderen en singletons uit te filteren.OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over software die wordt gebruikt voor chromatogramverwerking. Diepgaande protocollen over het verwerken van chromatogrammen met behulp van verschillende vrij beschikbare softwaretools, bijvoorbeeld MS-DIAL, MetAlign, MzMine en Xcalibur 19,20,21, worden verstrekt. Gebruik de ddMS2-gegevens van een gepoold QC-monster voor samengestelde annotatie. Beoordeel de moleculaire structuur door de mono-isotoopmassa te bepalen en gemeenschappelijke neutrale verliezen, bekende geladen aglyconen en verschillende soorten splitsingen, bijvoorbeeld homolytisch of heterolytisch16,22, waar te nemen. Volg voor het rapporteren van metabolietgegevens de aanbeveling beschreven in Fernie et al. 201123.OPMERKING: Verschillende computationele metabolomics-benaderingen kunnen worden gebruikt om metabolomics-gegevens te analyseren 24,25,26. 9. Normalisatie van grootschalige metabolomics dataset Controleer de verdeling van de interne standaard(s) en normaliseer door te corrigeren voor de respons van enkele of meerdere interne standaarden. Corrigeer de piekintensiteiten verkregen uit het chromatogram over het exacte monstergewicht door de piekintensiteiten te delen door het aliquote gehomogeniseerde monstergewicht uit stap 2.5. Correct voor intensiteitsdrift over multi-batch series. Voer op QC gebaseerde correctiemethoden uit, zoals loess (local estimated scatterplot smoothing)27 met R.OPMERKING: Er zijn verschillende tools en pakketten beschikbaar om de afwijking van de MS-prestaties tijdens de acquisitie van de hele batches 28,29 aan te pakken. Zorg voor een normale verdeling van eigenschappen door gegevenstransformatie, bijvoorbeeld Box-Cox-transformatie30 met behulp van de boxcox () -functie van het R-pakket MASS voor het uitvoeren van GWAS. Voer gegevensschaling uit, bijvoorbeeld Pareto-schaling, voor multivariate analyse om een juiste weging van laag overvloedige verbindingen te garanderen31.OPMERKING: Voer indien mogelijk een hersteltest uit om matrixeffecten te voorkomen, bijvoorbeeld ionenonderdrukking14. 10. Genoombrede associatiestudies (GWAS)32 Noem single nucleotide polymorphism (SNP) of structurele varianten (SV) uit de sequencinggegevens33,34. Filter genotypische gegevens voor minor allel frequency (MAF) 10% om laagfrequente bias met Tassel35 te voorkomen. Bereken de beste lineaire onbevooroordeelde voorspellingen (BLUP’s) voor elk genormaliseerd kenmerk over de experimentele herhalingen om vertekening afkomstig van omgevingsfactoren (willekeurige effecten) te elimineren met behulp van het R-pakket Ime436. Gebruik BLUP’s van elke functie afzonderlijk om GWAS uit te voeren met behulp van het rMVP-pakket in R37.OPMERKING: Elke metabolomics-functie wordt hier gezien als een individueel op zichzelf staand fenotype. Tijdens het uitvoeren van GWAS, correct voor populatiestructuur met behulp van principal component analysis (PCA) en identiteit per staat (IBS) of vanRaden om verstorende effecten te minimaliseren. Overweeg bovendien om een gemengd lineair model (MLM) of een multi-locus gemengd model (MLMM) te gebruiken, omdat gemengde modellen vaste en willekeurige effecten bevatten. 11. QTL-detectie Controleer de SNP’s die een significante associatie vertonen, rekening houdend met de Manhattan-plots, voor linkage disequilibrium (LD) -berekeningen om de onderliggende genetische regio te bepalen. Voer LD-berekeningen uit met behulp van de R-pakket LD-heatmap of Tassel 5. Controleer de geassocieerde SNP’s op de effectgrootte ten opzichte van de eigenschap door de eigenschapsniveaus te onderzoeken op statistische veranderingen tussen haplotypen om potentiële causale SNP’s te vinden, bijvoorbeeld SNP’s die leiden tot een aminozuurverandering in de eiwitcoderende sequentie, wat de fenotypische variatie zou kunnen verklaren.OPMERKING: Aangezien SNP-eigenschap associaties niet noodzakelijkerwijs causale associatie opleveren, is het cruciaal om het genomische gebied te bepalen. Samengestelde identiteit door kenmerkannotatie kan enorm helpen bij het vinden van de juiste kandidaatgenen in een specifiek genomisch gebied. We stellen voor om alle gedetecteerde QTL geassocieerd met bepaalde verbindingen in een pleiotrope kaart te combineren om de genetische regio’s38 te onderstrepen, zoals weergegeven in figuur 4. Voor validatie van kandidaatgenen kunnen verschillende benaderingen worden uitgevoerd (zie de discussie).