Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

A terapia genética utilizando vetores de vírus associados ao adeno (AAV) fez grandes avanços nas últimas três décadas^1,2. Melhorias demonstradas em uma variedade diversificada de doenças genéticas, incluindo cegueira congênita, hemofilia e doenças do sistema nervoso musculoesquelético e central, trouxeram a terapia genética AAV à vanguarda da pesquisa clínica^3,4. Em 2012, a Agência Europeia de Medicamentos (EMA) aprovou a Glybera, um vetor AAV1 que expressa lipoproteína lipase (LPL) para o tratamento da deficiência de LPL, tornando-se a primeira autorização de comercialização para um tratamento de terapia genética na Europa ou nos Estados Unidos⁵. Desde então, duas terapias genéticas AAV adicionais, Luxturna⁶ e Zolgensma^7,receberam aprovação da FDA, e espera-se que o mercado se expanda rapidamente nos próximos 5 anos, com até 10-20 terapias genéticas esperadas até 2025⁸. Os dados clínicos disponíveis indicam que a terapia genética AAV é uma modalidade segura, bem tolerada e eficaz, tornando-a um dos vetores virais mais promissores, com mais de 244 ensaios clínicos envolvendo AAV registrados com ClinicalTrials.gov. O crescente interesse por aplicações clínicas envolvendo vetores AAV requer métodos de produção robustos e escaláveis para facilitar a avaliação das terapias AAV em grandes modelos animais, pois este é um passo crítico no pipeline translacional⁹.

Para a produção de vetores AAV, os dois principais requisitos são o genoma AAV e o capsídeo. O genoma do tipo selvagem (wt)-AAV é um DNA de um único fio que tem aproximadamente 4,7 kb de comprimento¹⁰. O genoma wt-AAV compreende repetições terminais invertidas (ITRs) encontradas em ambas as extremidades do genoma, que são importantes para a embalagem, e os genes rep e cap ¹¹. Os genes de representação e tampa, necessários para a replicação do genoma, montagem do capsídeo viral e encapsulamento do genoma no capsídeo viral, são removidos do genoma viral e fornecidos em trans para a produção de vetores AAV¹². A remoção desses genes do genoma viral abre espaço para transgênicos terapêuticos e todos os elementos regulatórios necessários, incluindo o promotor e o sinal poliA. Os ITRs permanecem no genoma vetorial para garantir a replicação adequada do genoma e o encapsulamento viral^13,14. Para melhorar a cinética da expressão transgênica, os genomas vetores AAV podem ser projetados para serem autocons complementares, o que mitiga a necessidade de conversão de conversão de DNA de uma só vez para dupla mente durante a replicação do genoma AAV, mas reduz a capacidade de codificação para ~2,4 kb¹⁵.

Além do desenho do genoma AAV, a seleção do sorotipo capsid determina o tropismo tecidual e celular do vetor AAV in vivo². Além do tropismo tecidual, diferentes sorotipos AAV têm sido mostrados para exibir cinética de expressão genética diferente¹⁶. Por exemplo, Zincarelli et al.¹⁷ classificaram diferentes sorotipos AAV em sorotipos de baixa expressão (AAV2, 3, 4, 5), sorotipos de expressão moderada (AAV1, 6, 8) e sorotipos de alta expressão (AAV7 e 9). Eles também categorizaram os sorotipos AAV em expressão de início lento (AAV2, 3, 4, 5) ou expressão de início rápido (AAV1, 6, 7, 8 e 9). Esses tropismos divergentes e cinéticas de expressão genética são devido a variações de aminoácidos nas proteínas capsóides, formações de proteína capsíide e interações com receptores/co-receptores de células hospedeiras¹⁸. Alguns capsídeos AAV têm características benéficas adicionais, como a capacidade de atravessar a barreira hemoencefálica após a administração intravascular (AAV9) ou residir em células musculares de longa duração para expressão transgênica durável (AAV6, 6.2FF, 8 e 9)^19,20.

Este artigo tem como objetivo detalhar um método econômico para produzir vetores AAV de alta pureza, alto título e grau de pesquisa para uso em modelos animais grandes pré-clínicos. A produção de AAV usando este protocolo é alcançada usando transfecção dual-plasmid em rim embrionário humano aderente (HEK)293 células cultivadas em pilhas de células. Além disso, o estudo descreve um protocolo para purificação cromatografia de afinidade de sulfato de heparina, que pode ser usado para sorotipos AAV que contêm domínios de ligação de heparina, incluindo AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 e DJ^21,22.

Uma série de sistemas de embalagem estão disponíveis para a produção de vetores AAV. Entre eles, o uso de um sistema de co-transfection de dois plasmídeos, nos quais os genes Rep e Cap e os genes auxiliares de anúncios (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 e VA RNA) estão contidos dentro de um plasmídeo (pHelper), tem algumas vantagens práticas sobre o método comum de transfecção de três plasmídeos (triplos), incluindo custo reduzido para produção plasmida^23,24 . O plasmídeo genoma AAV contendo o de expressão transgene (pTransgene), deve ser ladeado por ITRs, e não deve exceder ~4,7 kb de comprimento. O título vetorial e a pureza podem ser afetados pelo transgene devido a potenciais efeitos citotóxicos durante a transfecção. A avaliação da pureza vetorial é descrita aqui. Os vetores produzidos utilizando este método, que produzem um 1 x 10¹³ vg/mL para cada um, foram avaliados em camundongos, hamsters e modelos de animais ovinos.

Tabela 1: Composição das soluções necessárias. Informações necessárias, incluindo percentuais e volumes, de componentes necessários para diversas soluções ao longo do protocolo. Clique aqui para baixar esta Tabela.