大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成
Summary
ここでは、細胞スタックで増殖した付着HEK 293細胞とアフィニティークロマトグラフィー精製を用いた研究用AAVベクターの大規模生産に関する詳細な手順を提供する。このプロトコルは一貫して>1 x 1013 のベクターゲノム/mLを生成し、大規模な動物実験に適したベクター量を提供する。
Abstract
アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターは、ヒトに対して承認された3つのAAV遺伝子治療を有する、最も臨床的に進行した遺伝子治療ベクターの一つです。AAVの新しいアプリケーションの臨床進歩は、マウスなどの小さな動物モデルから、犬、羊、非ヒト霊長類を含むより大きな動物モデルへの移行を伴う。AAVを大型動物に投与する際の制限の1つは、大量の高い抗長ウイルスの要件である。懸濁細胞培養はAAVベクター産生のためのスケーラブルな方法であるが、いくつかの研究ラボは、装置(例えば、バイオリアクター)を有するか、またはこの方法でAAVを生成する方法を知っている。また、AAV価は、接着性HEK293細胞と比較して、HEK293細胞の懸濁液で産生される場合に有意に低いことが多い。ここで説明する、セルスタックを用いて大量の高力素AAVを製造する方法を説明する。AAV を引き起す詳細なプロトコルと、ベクター純度を検証する方法についても説明します。最後に、羊モデルにおけるAAV媒介トランスジーン発現の代表結果を提示する。この最適化されたAAVベクターを接着細胞で大規模に生産するためのプロトコルは、分子生物学の研究室が、より大きな動物モデルにおける新しいAAV療法の試験を進めることを可能にする。
Introduction
アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターを利用した遺伝子治療は、過去30年間で大きく進歩した1,2.先天性失明、血友病、および筋骨格系および中枢神経系の疾患を含む多様な遺伝性疾患の改善を実証し、AAV遺伝子治療を臨床研究の最前線に持ち込んだ3,4。2012年、欧州医薬品庁(EMA)は、LPL欠損症の治療のためにリポタンパク質リパーゼ(LPL)を発現するAAV1ベクターであるグリベラを承認し、欧州または米国のいずれかで遺伝子治療のための最初のマーケティング承認を受けました。それ以来、2つのAAV遺伝子治療、Luxturna6とZolgensma7は、FDAの承認を受けており、市場は2025年までに10〜20の遺伝子治療が予想され、今後5年間で急速に拡大すると予想されています 8.利用可能な臨床データは、AAV遺伝子治療が安全で、十分に許容され、有効性のあるモダリティであり、最も有望なウイルスベクターの1つであり、244以上の臨床試験が ClinicalTrials.gov に登録されていることを示しています。AAVベクターを含む臨床応用への関心の高まりは、大規模な動物モデルにおけるAAV療法の評価を容易にするために、堅牢でスケーラブルな生産方法を必要とします。
AAVベクターの生産の場合、2つの主な要件は、AAVゲノムとキャプシドです。野生型(wt)-AAVのゲノムは、長さ約4.7kbの一本鎖DNAである。wt-AAVゲノムは、ゲノムの両端に見られる反転末端反復(ITR)を含み、これは、包装にとって重要であり、repおよびcap遺伝子11とを含む。Repおよびcap遺伝子は、ゲノム複製に必要な、ウイルスキャプシドの組み立て、およびゲノムをウイルスキャプシドにカプセル化し、ウイルスゲノムから除去され、AAVベクター産生12のためのトランスで提供される。ウイルスゲノムからこれらの遺伝子を除去することにより、治療的トランス遺伝子およびプロモーターおよびポリAシグナルを含むすべての必要な調節要素の余地を提供する。ITRは、適切なゲノム複製およびウイルスカプセル化13、14を確実にするために、ベクターゲノムに残る。遺伝子導入発現の動態を改善するために、AAVベクターゲノムは自己相補的に設計することができ、AAVゲノム複製中の一本鎖から二本鎖DNA変換への変換の必要性を軽減するが、コーディング能力は〜2.4kb15に低下する。
AAVゲノム設計を超えて、カプシド血清型選択は、生体内2におけるAAVベクターの組織および細胞のトロピズムを決定する。組織トロピズムに加えて、異なるAAV血清型が異なる遺伝子発現動態16を示すことを示している。例えば、ジンガレッリら17は、異なるAAV血清型を低発現血清型(AAV2、3、4、5)に分類し、中程度の発現血清型(AAV1、6、8)、および高発現血清型(AAV7および9)を分類する。また、AAV血清型を遅発式(AAV2、3、4、5)または急速発症発現(AAV1、6、7、8、および9)に分類した。これらの異なる対流動性および遺伝子発現動態は、カプシドタンパク質におけるアミノ酸の変化、カプシドタンパク質形成、および宿主細胞受容体/共受容体18との相互作用によるものである。一部のAAVカプシドは、血管内投与後に血液脳関門を越える能力(AAV9)または持続性トランスジーン発現用の長生き筋細胞(AAV6、6.2FF、8、および9)19、20などの付加的な有益な特徴を有する。
本論文は、前臨床前の大型動物モデルで使用するための高純度、高力価、研究グレードのAAVベクターを製造するための費用対効果の高い方法を詳述することを目的とする。このプロトコルを用いたAAVの生産は、細胞スタックで増殖した接着ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞へのデュアルプラスミドトランスフェクションを使用して達成される。さらに、この研究は、ヘパリン硫酸親和性クロマトグラフィー精製のプロトコルを記述し、AAV2、3、6、6.2FF、13、およびDJ21、22を含むヘパリン結合ドメインを含むAAV血清型に使用することができる。
AAV ベクターの製造には、多数のパッケージング システムが用意されています。これらの中で、RepおよびCap遺伝子およびアドヘルパー遺伝子(E1A、E1B55K、E2A、E4orf6、およびVA RNA)が1つのプラスミド(pHelper)内に含まれる2プラスミド共トランスフェクションシステムの使用は、一般的な3種プラスミド(トリプル)トランスフェクション方法よりも実用的な利点を有する24000年2400年の産生に対するコストの削減を含む。.遺伝子導入発現カセット(pTransgene)を含むAAVゲノムプラスミドは、ITRによって横にされ、かつ、〜4.7kbの長さを超えてはなりません。ベクター力差および純度は、トランスフェクション中の細胞傷害作用の可能性に起因するトランスジーンの影響を受ける可能性がある。ベクター純度の評価は、本明細書に記載される。この方法を用いて産生されたベクターは、それぞれ1×10 13 vg/mLを生み出し、マウス、ハムスター、およびオビン動物モデルで評価した。
表1: 必要なソリューションの構成プロトコル全体でさまざまなソリューションに必要なコンポーネントの割合やボリュームなどの必要な情報。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文で説明する組換えAAV(rAAV)ベクターの製造は、分子生物学の研究室や施設の大部分に見られる一般的な材料、試薬、および装置を使用しています。本論文は、高品質 のインビトロ および インビボ グレードrAAVを読者が生産することを可能にする。とりわけ、rAAV製造のためのこのプロトコルは、塩化セシウム精製を含むより退屈なプロトコルと比較して、効率的であり、超?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アミラ・D・Rghei,ブレナ・A・Y・スティーブンス,シルビア・P・トーマス,ジェイコブ・G・E・イェーツは,オンタリオ獣医大学学生奨学金とオンタリオ州大学院奨学金の受給者でした。アミラ・D・ルガイは、学生シップを加速するミタクの受領者でした。この研究は、カナダ保健研究所(CIHR)プロジェクトグラント(#66009)とSKWへの共同健康研究プロジェクト(NSERC提携)助成金(#433339)によって資金提供されました。
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
References
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