Produzione di vettori virali adeno-associati in pile cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni

La terapia genica che utilizza vettori di virus adeno-associati (AAV) ha fatto passi da gigante negli ultimi tre decenni^1,2. I miglioramenti dimostrati in una vasta gamma di malattie genetiche, tra cui cecità congenita, emofilia e malattie del sistema muscolo-scheletrico e del sistema nervoso centrale, hanno portato la terapia genica AAV in prima linea nella ricerca clinica^3,4. Nel 2012, l’Agenzia europea per i medicinali (EMA) ha approvato Glybera, un vettore AAV1 che esprime lipoproteina lipasi (LPL) per il trattamento del deficit di LPL, rendendolo la prima autorizzazione all’immissione in commercio per un trattamento di terapia genica in Europa o negli Stati Uniti⁵. Da allora, due ulteriori terapie geniche AAV, Luxturna⁶ e Zolgensma^7,hanno ricevuto l’approvazione della FDA e il mercato dovrebbe espandersi rapidamente nei prossimi 5 anni con ben 10-20 terapie geniche previste entro il 2025⁸. I dati clinici disponibili indicano che la terapia genica AAV è una modalità sicura, ben tollerata ed efficace che la rende uno dei vettori virali più promettenti, con oltre 244 studi clinici che coinvolgono AAV registrati con ClinicalTrials.gov. Il crescente interesse per le applicazioni cliniche che coinvolgono vettori AAV richiede metodi di produzione robusti e scalabili per facilitare la valutazione delle terapie AAV in modelli animali di grandi dimensioni, in quanto questo è un passo critico nella pipeline traslazionale⁹.

Per la produzione di vettori AAV, i due requisiti principali sono il genoma AAV e il capside. Il genoma di wild-type (wt)-AAV è DNA a singolo filamento che è di circa 4,7 kb di lunghezza¹⁰. Il genoma wt-AAV comprende ripetizioni terminali invertite (ITR) che si trovano ad entrambe le estremità del genoma, che sono importanti per il packaging, e i geni rep e cap ¹¹. I geni rep e cap, necessari per la replicazione del genoma, l’assemblaggio del capside virale e l’incapsulamento del genoma nel capside virale, vengono rimossi dal genoma virale e forniti in trans per la produzione di vettori AAV¹². La rimozione di questi geni dal genoma virale fornisce spazio per i transgeni terapeutici e tutti gli elementi regolatori necessari, tra cui il promotore e il segnale polyA. Gli ITR rimangono nel genoma vettoriale per garantire una corretta replicazione del genoma e l’incapsulamento virale^13,14. Per migliorare la cinetica dell’espressione transgenica, i genomi vettoriali AAV possono essere progettati per essere auto-complementari, il che mitiga la necessità di conversione dalla conversione del DNA a singolo filamento a quella a doppio filamento durante la replicazione del genoma AAV, ma riduce la capacità di codifica a ~ 2,4 kb¹⁵.

Oltre alla progettazione del genoma AAV, la selezione del sierotipo del capside determina il tropismo tissutale e cellulare del vettore AAV in vivo². Oltre al tropismo tissutale, diversi sierotipi AAV hanno dimostrato di mostrare diverse cinetiche di espressione^{genica 16}. Ad esempio, Zincarelli et al.¹⁷ hanno classificato diversi sierotipi AAV in sierotipi a bassa espressione (AAV2, 3, 4, 5), sierotipi a espressione moderata (AAV1, 6, 8) e sierotipi ad alta espressione (AAV7 e 9). Hanno anche classificato i sierotipi AAV in espressione ad esordio lento (AAV2, 3, 4, 5) o espressione ad esordio rapido (AAV1, 6, 7, 8 e 9). Questi tropismi divergenti e la cinetica di espressione genica sono dovuti a variazioni aminoacidiche nelle proteine del capside, formazioni di proteine del capside e interazioni con i recettori / co-recettori delle cellule ospiti¹⁸. Alcuni capsidi AAV hanno caratteristiche benefiche aggiuntive come la capacità di attraversare la barriera emato-encefalica dopo somministrazione intravascolare (AAV9) o risiedere in cellule muscolari longeve per un’espressione transgenica duratura (AAV6, 6.2FF, 8 e 9)^19,20.

Questo documento mira a dettagliare un metodo economico per la produzione di vettori AAV ad alta purezza, ad alto titolo e di grado di ricerca da utilizzare in modelli preclinici di animali di grandi dimensioni. La produzione di AAV utilizzando questo protocollo è ottenuta utilizzando la trasfezione a doppio plasmide in cellule aderenti del rene embrionale umano (HEK) 293 coltivate in pile cellulari. Inoltre, lo studio descrive un protocollo per la purificazione della cromatografia dell’affinità dell’eparina solfato, che può essere utilizzato per i sierotipi AAV che contengono domini leganti l’eparina, tra cui AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 e DJ^21,22.

Sono disponibili numerosi sistemi di imballaggio per la produzione di vettori AAV. Tra questi, l’uso di un sistema di co-trasfezione a due plasmidi, in cui i geni Rep e Cap e i geni Ad helper (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 e VA RNA) sono contenuti all’interno di un plasmide (pHelper), presenta alcuni vantaggi pratici rispetto al comune metodo di trasfezione a tre plasmidi (triplo), tra cui costi ridotti per la produzione di plasmidi^23,24 . Il plasmide del genoma AAV contenente la cassetta di espressione transgenica (pTransgene), deve essere affiancato da ITR e non deve superare ~ 4,7 kb di lunghezza. Il titolo e la purezza del vettore possono essere influenzati dal transgene a causa dei potenziali effetti citotossici durante la trasfezione. La valutazione della purezza del vettore è descritta nel presente documento. I vettori prodotti con questo metodo, che producono un 1 x 10¹³ vg / mL per ciascuno, sono stati valutati in topi, criceti e modelli animali ovini.

Tabella 1: Composizione delle soluzioni richieste. Informazioni necessarie, incluse percentuali e volumi, dei componenti necessari per varie soluzioni in tutto il protocollo. Fare clic qui per scaricare questa tabella.