ייצור וקטורים הקשורים אדנו וירוס בערימות תאים למחקרים פרה קליניים במודלים בעלי חיים גדולים
Summary
כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור בקנה מידה גדול של וקטורים AAV ברמה מחקרית באמצעות תאי HEK 293 דבקים הגדלים בערימות תאים וטיהור כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי >1 x 1013 גנומים וקטוריים /mL, ומספק כמויות וקטוריות המתאימות למחקרים גדולים בבעלי חיים.
Abstract
וקטורים הקשורים לווירוסים הקשורים לאדנו (AAV) הם בין וקטורי הטיפול הגנטי המתקדמים ביותר מבחינה קלינית, עם שלושה טיפולים גנטיים AAV שאושרו לבני אדם. קידום קליני של יישומים חדשניים עבור AAV כרוך במעבר ממודלים קטנים של בעלי חיים, כגון עכברים, למודלים בעלי חיים גדולים יותר, כולל כלבים, כבשים ופרימטים לא אנושיים. אחת המגבלות של מתן AAV לבעלי חיים גדולים יותר היא הדרישה לכמויות גדולות של וירוס טיטר גבוה. בעוד שתרבית תאי ההשעיה היא שיטה מדרגית לייצור וקטור AAV, מעבדות מחקר מעטות יש את הציוד (למשל, bioreactors) או יודע איך לייצר AAV באופן זה. יתר על כן, TITERS AAV הם לעתים קרובות נמוך באופן משמעותי כאשר מיוצרים השעיה HEK 293 תאים לעומת תאי HEK293 דבק. המתואר כאן היא שיטה לייצור כמויות גדולות של AAV titer גבוהה באמצעות ערימות תאים. פרוטוקול מפורט עבור titering AAV, כמו גם שיטות לאימות טוהר וקטור מתוארים גם. לבסוף, מוצגות תוצאות מייצגות של ביטוי טרנסג’ן בתיווך AAV במודל כבשים. פרוטוקול ממוטב זה לייצור בקנה מידה גדול של וקטורים AAV בתאים חסידים יאפשר מעבדות ביולוגיה מולקולרית לקדם את הבדיקה של טיפולים AAV החדש שלהם במודלים בעלי חיים גדולים יותר.
Introduction
טיפול גנטי המשתמש בווקטורים הקשורים לווירוסים הקשורים לאדנו (AAV) עשה צעדים עצומים בשלושת העשורים האחרונים1,2. שיפורים שהפגינו במגוון רחב של מחלות גנטיות, כולל עיוורון מולד, המופיליה ומחלות של מערכת העצבים השלד והמרכז, הביאו את הטיפול הגנטי AAV לחזית המחקר הקליני3,4. בשנת 2012, סוכנות התרופות האירופית (EMA) אישרה את Glybera, וקטור AAV1 המבטא ליפופרוטאין ליפאז (LPL) לטיפול במחסור ב- LPL, מה שהופך אותו לאישור השיווק הראשון לטיפול גנטי באירופה או בארצות הברית5. מאז, שני טיפולים גנטיים נוספים של AAV, Luxturna6 ו- Zolgensma 7 ,קיבלואת אישור ה-FDA, והשוק צפוי להתרחב במהירות במהלך 5 השנים הקרובות עם עד 10-20 טיפולים גנטיים הצפויים עד 20258. נתונים קליניים זמינים מצביעים על כך שטיפול גנטי AAV הוא מודל בטוח, נסבל היטב ויעיל, מה שהופך אותו לאחד הווקטורים הנגיפיים המבטיחים ביותר, עם מעל 244 ניסויים קליניים מעורבים AAV רשום עם ClinicalTrials.gov. העניין הגובר ביישומים קליניים המערבים וקטורים AAV דורש שיטות ייצור חזקות ומדרגיות כדי להקל על הערכת טיפולים AAV במודלים בעלי חיים גדולים, שכן זהו צעד קריטי בצינור התרגומי9.
עבור ייצור וקטור AAV, שתי הדרישות העיקריות הן הגנום AAV ואת capsid. הגנום של סוג בר (wt)-AAV הוא DNA חד גדילי כי הוא כ 4.7 kbאורך 10. הגנום wt-AAV כולל חזרות מסוף הפוכות (ITRs) שנמצאות בשני קצות הגנום, החשובות לאריזה, ואת הגנים של הנציג והכובע 11. הגנים נציג וכובע, הדרושים לשכפול הגנום, הרכבה של קפסיד ויראלי, אנקפסולציה של הגנום לתוך קפסיד ויראלי, מוסרים מן הגנום הנגיפי מסופקים טרנס לייצור וקטור AAV12. הסרת גנים אלה מהגנום הנגיפי מספקת מקום לטרנסגנים טיפוליים ולכל האלמנטים הרגולטוריים הדרושים, כולל המקדם ואות הפוליה. ה- ITRs נשארים בגנום הווקטורי כדי להבטיח שכפול גנום תקין ו אנקפסולציה ויראלית13,14. כדי לשפר את הקינטיקה של ביטוי טרנסג’ן, ניתן להנדס גנומים וקטוריים של AAV להיות משלימים את עצמם, מה שמפחית את הצורך בהמרה ממרת דנ”א חד-גדילית לדו-גדילית במהלך שכפול הגנום של AAV, אך מפחית את יכולת הקידוד ל- ~ 2.4 kb15.
מעבר לעיצוב הגנום של AAV, בחירת הסרוטיפ קבסידי קובעת את הרקמה ואת tropism התא של וקטור AAV ב vivo2. בנוסף לטרופיזם רקמה, סרוטיפים שונים של AAV הוכחו כמציגים קינטיקה שונה של ביטויגנים 16. לדוגמה, זינצרליואח’ 17 סיווגו סרוטיפים שונים של AAV לסרוטיפים בעלי הבעה נמוכה (AAV2, 3, 4, 5), סרוטיפים מתונים (AAV1, 6, 8) וסרוטיפים בעלי ביטוי גבוה (AAV7 ו-9). הם גם סיווגו סרוטיפים של AAV לביטוי פתיחה איטית (AAV2, 3, 4, 5) או ביטוי פתיחה מהירה (AAV1, 6, 7, 8 ו-9). טרופיזם מפוצלים אלה וביטוי גנים קינטיקה נובעים וריאציות חומצת אמינו חלבונים קפסיד, תצורות חלבון capsid, ואינטראקציות עם קולטני תא מארח / קולטנים משותפים18. כמה capsids AAV יש מאפיינים מועילים נוספים כגון היכולת לחצות את מחסום הדם – מוח בעקבות ניהול תוך כלי דם (AAV9) או מתגוררים בתאי שריר חיים ארוכים עבור ביטוי transgene עמיד (AAV6, 6.2FF, 8, ו 9)19,20.
מאמר זה נועד לפרט שיטה חסכונית לייצור וקטורים AAV באיכות גבוהה, בעלי טוהר גבוה, ברמת מחקר לשימוש במודלים פרה-אקליניים של בעלי חיים גדולים. ייצור AAV באמצעות פרוטוקול זה מושגת באמצעות transfection כפול פלסמיד לתוך כליות עובריות אנושיות דבקות (HEK)293 תאים הגדלים בערימות תאים. יתר על כן, המחקר מתאר פרוטוקול עבור טיהור כרומטוגרפיה זיקה הפרין גופרתי, אשר יכול לשמש עבור סרוטיפים AAV המכילים תחומים מחייב הפרין, כולל AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13, ו DJ21,22.
מספר מערכות אריזה זמינות לייצור וקטורים AAV. בין אלה, השימוש במערכות שיתוף פעולה דו-פלסמיד, שבהן הגנים Rep ו- Cap וגנים מסייעים עד (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 ו- VA RNA) כלולים בתוך פלסמיד אחד (pHelper), יש כמה יתרונות מעשיים על פני שיטת טרנספקטציה נפוצה של שלושה פלסמיד (משולש), כולל עלות מופחתת לייצור plasmid23,24 . גנום AAV plasmid המכיל את קלטת הביטוי transgene (pTransgene), חייב להיות מוקף על ידי ITRs, ואסור לחרוג ~ 4.7 kb אורך. טיטר וקטור וטוהר יכול להיות מושפע טרנסג’ן בשל השפעות ציטוטוקסיות פוטנציאליות במהלך transfection. הערכה של טוהר וקטור מתוארת כאן. וקטורים המיוצרים בשיטה זו, אשר מניבים 1 x 1013 vg / mL עבור כל אחד, הוערך בעכברים, אוגרים, מודלים בעלי חיים הביצית.
טבלה 1: הרכב הפתרונות הנדרשים. מידע הכרחי, כולל אחוזים ואמצעי אחסון, של רכיבים הדרושים לפתרונות שונים לאורך הפרוטוקול. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הייצור של וקטורים AAV רקומביננטיים (rAAV) המתוארים במאמר זה משתמש בחומרים נפוצים, ריאגנטים, וציוד שנמצא ברוב המעבדות והמתקנים למחקר ביולוגיה מולקולרית. מאמר זה מאפשר ייצור באיכות גבוהה במבחנה וב-in vivo כיתה rAAV על ידי הקורא. מעל לכל, פרוטוקול זה לייצור rAAV, בהשוואה לפרוטוקולים מייגעים יו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אמירה ד. ראג’י, ברנה א. י. סטיבנס, סילביה פ. תומאס וג’ייקוב ג’י אי ייטס היו מקבלים מלגות סטודנטים לסטודנטים וטרינריים באונטריו וכן מלגות בוגרים של אונטריו. אמירה ד. ראג’י קיבלה תואר שני בסטודנטית מואצת. עבודה זו מומנה על ידי מענק הפרויקט של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) (#66009) ומענק לחקר הבריאות השיתופי (NSERC שותף) (#433339) ל- SKW.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| 10 chamber cellstack | Corning | 3271 | |
| 1L PETG bottle | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96-well skirted plate | FroggaBio | FS-96 | |
| Adhesive plate seals | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Blood and Tissue Clean up Kit | Qiagen | 69506 | Use for DNA clean up in section 4.6 of protocol |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Cell Culture Dishes | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm plates |
| Culture Conical Tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL conical tube |
| Culture Conical Tube | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL conical tube |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| Ethanol | Greenfield | P016EA95 | Dilute ethyl alcohol(95% vol) to 20% for section 3.7.4 and 70% for section 6.1.1.1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 cells | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in manufacturer’s protocol. Once cells have been minimally passaged and are growing well, freeze a subfraction for future in aliquots and store in liquid nitrogen. Always use cells below passage number 30. Once cultured cells have been passaged more than 30 times, it is recommended to restart a culture from the stored aliquots |
| HEK293 host cell protein ELISA kit | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer’s instructions |
| Heparin sulfate column | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| Large Volume Centrifuge Tube Support Cushion | Corning | CLS431124 | Support cushion must be used with large volume centrifuge tubes uless the centrifuge rotor has the approriate V-bottom cushions |
| Large Volume Centrifuge Tubes | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL centrifuge tubes |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL microcentrifuge tube, sterilize prior to use |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | CAUTION. Wear gloves |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | Sterilize prior to use |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Dilute to 1x for use on cells |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | Purchase sterile pipet basins |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | CAUTION. Wear gloves |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 24765-1 | Follow manufacturer’s instructions to produce a 1L solution. 0.22μm filter and store at 4°C |
| Polypropylene semi-skirted PCR Plate | FroggaBio | WS-96 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | CAUTION. Wear gloves |
| polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Cytiva Life Sciences | 10600023 | Use forceps to manipulate. Wear gloves. |
| Primary antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | Must contain SV40 polyA in genome to be compatible with AAV titration in section 5.0 |
| Pump tubing | Cole-Parmer | RK-96440-14 | Optimize length of tubing and containment of virus in fractions E1-E5 |
| RQ1 Dnase 10 Reaction Buffer | Promega | M6101 | Use at 10x concentration in protocol from section 4.0 |
| RQ1 Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | |
| Sample dilutent | Cygnus Technologies | I700 | Must be purchased separately for use with HEK293 host cell protein ELISA kit |
| Secondary antibody, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| Skim milk powder | Oxoid | LP0033B | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 polyA primer probe | IDT | Use sequence in Table X for quote from IDT for synthesis | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K device must be used, as it has a 10000 molecular weight cutoff |
| Universal Nuclease for cell lysis | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| Universal qPCR master mix | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 21985023 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| CAUTION: Refer to the Materials Table for guidelines on the use of dangerous chemicals. |
References
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020)
- FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020)
- Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020)
- Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
- Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
- Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
- Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
- Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
- Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
- Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
- van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
- Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
- Liu, J., Moon, Y. -. A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601 (2019).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- . Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996)
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
- Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
- Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124 (2012).
