Protein Düşük Yatan Konformasyon durumlarını tespit etmek için Yüksek Basınçlı NMR Deneyleri
Summary
Yüksek basınçlı bir hücreyi monte etmek, yüksek basınçlı NMR deneylerini kurmak ve kaydetmek ve son olarak basınç altında hem pik yoğunluk hem de kimyasal kayma değişikliklerini analiz etmek için gereken adımların ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Bu deneyler, proteinlerin katlanır yolları ve yapısal stabilitesi hakkında değerli içgörüler sağlayabilir.
Abstract
Yüksek basınç, küresel proteinlerin dengesini bozmak ve protein komplekslerini ters çevrilebilir bir şekilde ayrıştırmak için kullanılabilecek iyi bilinen bir pertürbasyon yöntemidir. Hidrostatik basınç termodinamik dengeyi daha düşük azı dişi hacmi ile durum(lar)a doğru yönlendirir. Artan basınç, bu nedenle, küresel proteinlerin stabilitesini ve protein komplekslerinin oligomerizasyon dengesini ince bir şekilde ayarlama fırsatları sunar. Yüksek basınçlı NMR deneyleri, basınç pertürbasyonunun ince stabilite ayar yeteneğini ve çözelti NMR spektroskopisi tarafından sunulan saha çözünürlüğünü birleştirerek globüler proteinlerin stabilitesini, katlama mekanizmalarını ve oligomerizasyon mekanizmalarını yöneten faktörlerin ayrıntılı bir şekilde karakterizasyonuna izin verir. Burada, 1 bar’dan 2,5 kbar’a kadar kaydedilen 2D 1H-15N deneyleri seti aracılığıyla bir proteinin yerel katlama stabilitesini araştırmak için bir protokol sunuyoruz. Bu tür deneylerin alınması ve analizi için gereken adımlar, hnRNPA1’in RRM2 etki alanında elde edilen verilerle gösterilmiştir.
Introduction
Proteinlerin ve protein komplekslerinin daha yüksek enerjili, seyrek nüfuslu konformasyon durumlarının birçok biyolojik yolda kilit rol oynadığı uzun zamandır kabul edilmektedir1,2,3. Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Kimyasal Değişim Doygunluk Transferi (Tsİ)5ve karanlık durum değişim doygunluk transferi (DEST)6 darbe dizisi (diğerleri arasında) tabanlı deneyler sayesinde, çözelti NMR spektroskopisi geçici uygun durumları karakterize etmek için bir seçim yöntemi olarak ortaya çıkmıştır7. Bu deneylerle birlikte, daha yüksek enerji konformasyonel alt durumlarının göreli popülasyonunu artırmak için sıcaklık, pH veya kimyasal denatürantlar gibi pertürbasyonlar da tanıtılabilir. Benzer şekilde, protein dengesi de yüksek hidrostatik basınç uygulanarak bozılabilir. İlgili konformasyon değişiklikleriyle ilişkili hacim değişiminin büyüklüğüne bağlı olarak, basıncın birkaç yüz ila birkaç bin çubuk artması, daha yüksek bir enerji durumunu önemli ölçüde stabilize edebilir veya bir proteinintamamen ortayaçıkmasına neden olabilir 8 ,9,10. Protein NMR spektrumu tipik olarak hidrostatik basınçla iki tür değişiklik gösterir: (i) kimyasal kayma değişiklikleri ve (ii) pik yoğunluk değişiklikleri. Kimyasal kayma değişiklikleri, protein yüzey suyu arayonundaki değişiklikleri ve/veya protein yapısının hızlı bir zaman ölçeğinde (NMR zaman ölçeğine göre) yerel sıkıştırmasını yansıtır11. Büyük doğrusal olmayan kimyasal kaymalar gösteren çapraz geçişler basınç bağımlılığı, daha yüksek enerji konformasyon durumlarının varlığını gösterebilir12,13. Öte yandan, pik yoğunluk değişiklikleri, katlanmış/katlanmış durum popülasyonlarındaki değişiklikler gibi yavaş bir zaman ölçeğinde büyük konformasyon geçişlerine işaret eder. Katlanır ara maddelerin veya daha yüksek enerji durumlarının varlığı, belirli bir proteinin farklı kalıntıları için ölçülen açma üzerine hacim değişiminin büyüklüğündeki büyük varyasyonlardan tespit edilebilir14,15,16,17. Deneyimlerimize dayanarak, tipik olarak iki durumlu klasörler olarak sınıflandırılan küçük proteinler bile, yerel katlama stabiliteleri hakkında yararlı bilgiler sağlayan basınca karşı tekdüze olmayan yanıtlar sergiler. Burada açıklanan, heterojen nükleer ribonükleoprotein A1’in(hnRNPA1) izole RNA tanıma motifi 2’yi (RRM2) model protein olarak kullanarak, amide tepe yoğunluğu ve 1 H kimyasal kayma basınç bağımlılığının kazanılması ve analizi için bir protokoldür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, protein yapısal ve termodinamik yanıtlarının basınç pertürbasyonuna araştırılması için uygulanan bir protokol ayrıntılı olarak yer alıyor. Burada RRM2’de kaydedilen yüksek basınç deneyleri, ΔVU değerlerinde, tamamen işbirliğine bağlı olmayan açılmanın göstergesi olan büyük varyasyonların nispeten küçük bir tek alan proteininde bulunabileceğini göstermektedir. Benzer bir tablo basınç altında 1H kimyasal kayma değişikliklerinin analizinden ort…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Roy J. Carver Hayır Kurumu’ndan Julien Roche’a fonlar tarafından desteklendi. J. D. Levengood ve B. S. Tolbert’e RRM2 örneğini sağladıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins’ behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. . Sparky 3. , (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
