Experimentos de RMN de alta presión para detectar estados conformacionales de baja altitud de proteínas
Summary
Proporcionamos una descripción detallada de los pasos necesarios para ensamblar una celda de alta presión, configurar y registrar experimentos de RMN de alta presión y, finalmente, analizar tanto la intensidad máxima como los cambios de cambio químico bajo presión. Estos experimentos pueden proporcionar información valiosa sobre las vías de plegamiento y la estabilidad estructural de las proteínas.
Abstract
La alta presión es un método de perturbación bien conocido que se puede utilizar para desestabilizar las proteínas globulares y disociar los complejos de proteínas de manera reversible. La presión hidrostática impulsa los equilibrios termodinámicos hacia el estado (s) con el volumen molar más bajo. El aumento de la presión ofrece, por lo tanto, la oportunidad de ajustar finamente la estabilidad de las proteínas globulares y los equilibrios de oligomerización de los complejos de proteínas. Los experimentos de RMN de alta presión permiten una caracterización detallada de los factores que gobiernan la estabilidad de las proteínas globulares, sus mecanismos de plegamiento y los mecanismos de oligomerización mediante la combinación de la capacidad de ajuste de estabilidad fina de la perturbación de la presión y la resolución del sitio ofrecida por la espectroscopia de RMN de solución. Aquí presentamos un protocolo para sondear la estabilidad de plegamiento local de una proteína a través de un conjunto de experimentos 2D 1H-15N registrados desde 1 bar hasta 2.5 kbar. Los pasos necesarios para la adquisición y el análisis de tales experimentos se ilustran con datos adquiridos en el dominio RRM2 de hnRNPA1.
Introduction
Durante mucho tiempo se ha reconocido que los estados conformacionales de mayor energía y escasamente poblados de proteínas y complejos de proteínas desempeñan un papel clave en muchas vías biológicas1,2,3. Gracias a experimentos basados en secuencias de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5y dark-state exchange saturation transfer (DEST)6 (entre otras), la espectroscopia de RMN en solución ha surgido como un método de elección para caracterizar estados conformacionales transitorios7. Junto con estos experimentos, se pueden introducir perturbaciones como la temperatura, el pH o los desnaturalizantes químicos para aumentar la población relativa de subestados conformacionales de mayor energía. Del mismo modo, los equilibrios de proteínas también pueden ser perturbados mediante la aplicación de alta presión hidrostática. Dependiendo de la magnitud del cambio de volumen asociado con los cambios conformacionales correspondientes, un aumento de la presión de unos pocos cientos a unos pocos miles de bares puede estabilizar significativamente un estado de energía más alto o hacer que una proteína se despliegue completamente8,9,10. Los espectros de RMN de proteínas suelen mostrar dos tipos de cambios con presión hidrostática: (i) cambios de cambio químico y (ii) cambios de intensidad máxima. Los cambios químicos reflejan cambios en la interfaz proteína superficie-agua y/o compresión local de la estructura de la proteína en una escala de tiempo rápida (en relación con la escala de tiempo de RMN)11. Los cruces que exhiben grandes cambios químicos no lineales la dependencia de la presión pueden indicar la presencia de estados conformacionales de mayor energía12,13. Por otro lado, los cambios de intensidad máxima apuntan a transiciones conformacionales importantes en una escala de tiempo lenta, como cambios en las poblaciones de estados plegados / desplegados. La presencia de intermedios plegables o estados de energía superior se puede detectar a partir de grandes variaciones en la magnitud del cambio de volumen al desplegarse medido para diferentes residuos de una proteína dada14,15,16,17. Según nuestra experiencia, incluso las proteínas pequeñas que generalmente se clasifican como carpetas de dos estados exhiben respuestas no uniformes a la presión, lo que proporciona información útil sobre su estabilidad de plegamiento local. Aquí se describe un protocolo para la adquisición y análisis de la intensidad máxima de la amida y la dependencia de la presión de los cambios químicos de 1H, utilizando como proteína modelo el motivo de reconocimiento de ARN aislado 2 (RRM2) de la ribonucleoproteína nuclear heterogénea A1 (hnRNPA1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio detalla un protocolo implementado para sondear las respuestas estructurales y termodinámicas de las proteínas a la perturbación de la presión. Los experimentos de alta presión registrados aquí en RRM2 demuestran que se pueden encontrar grandes variaciones en los valores de ΔVU, indicativos de un despliegue no totalmente cooperativo, en una proteína de dominio único relativamente pequeña. Una imagen similar surge del análisis de los cambios de cambio químico de 1H bajo presi?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos del Roy J. Carver Charitable Trust a Julien Roche. Agradecemos a J. D. Levengood y B. S. Tolbert por proporcionar amablemente la muestra RRM2.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
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