Эксперименты ямР высокого давления для обнаружения белковых низколежащих конформационных состояний
Summary
Мы предоставляем подробное описание этапов, необходимых для сборки ячейки высокого давления, настройки и записи экспериментов с ЯМР высокого давления и, наконец, анализа как пиковой интенсивности, так и изменений химического сдвига под давлением. Эти эксперименты могут дать ценную информацию о путях сворачивания и структурной стабильности белков.
Abstract
Высокое давление является хорошо известным методом возмущения, который может быть использован для дестабилизации глобулярных белков и диссоциации белковых комплексов обратимым образом. Гидростатическое давление приводит термодинамическое равновесие к состоянию (состояниям) с меньшим молярным объемом. Таким образом, повышение давления дает возможность точно настроить стабильность глобулярных белков и равновесия олигомеризации белковых комплексов. Эксперименты с ЯМР высокого давления позволяют детально охарактеризовать факторы, управляющие стабильностью глобулярных белков, механизмы их сворачивания и механизмы олигомеризации, сочетая способность тонкой настройки стабильности возмущения давлением и разрешение сайта, предлагаемое растворной ЯМР-спектроскопией. Здесь мы представляем протокол для исследования локальной стабильности сворачивания белка с помощью набора экспериментов 2D 1H-15N, записанных от 1 бар до 2,5 кбар. Шаги, необходимые для получения и анализа таких экспериментов, иллюстрируются данными, полученными по домену RRM2 hnRNPA1.
Introduction
Давно признано, что высокоэнергетические, малонаселенные конформационные состояния белков и белковых комплексов играют ключевую роль во многих биологических путях1,2,3. Благодаря экспериментам, основанным на последовательностях импульсов Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (CPMG)4,переноса насыщения химического обмена (CEST)5и переносанасыщения обмена в темном состоянии (DEST) 6 (среди прочих), раствор ЯМР-спектроскопии появился в качестве метода выбора для характеристики переходных конформационных состояний7. Наряду с этими экспериментами могут быть введены возмущения, такие как температура, рН или химические денатуранты, чтобы увеличить относительную популяцию конформационных субсостояний с более высокой энергией. Аналогичным образом, белковые равновесия также могут быть возмущены применением высокого гидростатического давления. В зависимости от величины изменения объема, связанного с соответствующими конформационными изменениями, увеличение давления на несколько сотен до нескольких тысяч бар может значительно стабилизировать более высокое энергетическое состояние или привести к полному раскрытию белкана 8,9,10. Спектры ЯМР белка обычно отображают два типа изменений с гидростатическим давлением: (i) изменения химического сдвига и (ii) изменения пиковой интенсивности. Изменения химического сдвига отражают изменения на границе раздела белка с поверхностью воды и/или локальное сжатие структуры белка в быстрой шкале времени (относительно шкалы времени ЯМР)11. Поперечные спицы, демонстрирующие большие нелинейные химические сдвиги зависимости давления, могут указывать на наличие более высоких энергетических конформационных состояний12,13. С другой стороны, изменения пиковой интенсивности указывают на крупные конформационные переходы в медленной шкале времени, такие как изменения в сложенных / развернутых популяциях состояний. Наличие складчатых промежуточных продуктов или более высоких энергетических состояний может быть обнаружено по большим вариациям величины изменения объема при развертывании, измеренному для различных остатков данного белка14,15,16,17. Основываясь на нашем опыте, даже небольшие белки, которые обычно классифицируются как папки с двумя состояниями, демонстрируют неоднородные реакции на давление, что дает полезную информацию об их локальной стабильности сворачивания. Здесь описан протокол получения и анализа зависимости от амидных пиковых и химических сдвигов 1H, использующих в качестве модели белка изолированный мотив распознавания РНК 2 (RRM2) гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина A1 (hnRNPA1).
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании подробно описывается протокол, реализованный для исследования структурных и термодинамических реакций белка на возмущение давления. Эксперименты с высоким давлением, записанные здесь на RRM2, демонстрируют, что большие вариации значений ΔVU, свидетельствующие…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана средствами благотворительного фонда Роя Карвера Жюльена Роша. Мы благодарим J. D. Levengood и B. S. Tolbert за любезное предоставление образца RRM2.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins’ behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. . Sparky 3. , (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
