Hochdruck-NMR-Experimente zum Nachweis von proteinarmen Konformationszuständen
Summary
Wir bieten eine detaillierte Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um eine Hochdruckzelle zusammenzubauen, Hochdruck-NMR-Experimente einzurichten und aufzuzeichnen und schließlich sowohl die Spitzenintensität als auch chemische Verschiebungsänderungen unter Druck zu analysieren. Diese Experimente können wertvolle Einblicke in die Faltungswege und die strukturelle Stabilität von Proteinen liefern.
Abstract
Hochdruck ist eine bekannte Störungsmethode, mit der globuläre Proteine destabilisiert und Proteinkomplexe reversibel dissoziiert werden können. Hydrostatischer Druck treibt thermodynamische Gleichgewichte in Richtung des/der Zustand(e) mit dem unteren molaren Volumen. Steigender Druck bietet daher die Möglichkeit, die Stabilität von kugelförmigen Proteinen und die Oligomerisierungsgleichgewichte von Proteinkomplexen fein abzustimmen. Hochdruck-NMR-Experimente ermöglichen eine detaillierte Charakterisierung der Faktoren, die die Stabilität von kugelförmigen Proteinen, ihre Faltungsmechanismen und Oligomerisierungsmechanismen steuern, indem die Feinstabilitätsabstimmungsfähigkeit der Druckstörung und die Standortauflösung der Lösungs-NMR-Spektroskopie kombiniert werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der lokalen Faltungsstabilität eines Proteins über eine Reihe von 2D-1H-15N-Experimenten, die von 1 bar bis 2,5 kbar aufgezeichnet wurden. Die für die Erfassung und Analyse solcher Experimente erforderlichen Schritte werden anhand von Daten veranschaulicht, die auf der RRM2-Domäne von hnRNPA1 erfasst wurden.
Introduction
Es ist seit langem bekannt, dass energiereichere, dünn besiedelte Konformationszustände von Proteinen und Proteinkomplexen eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Signalwegen spielen1,2,3. Dank Experimenten, die unter anderem auf Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5und Dark-State Exchange Saturation Transfer (DEST)6 Pulssequenzen basieren, hat sich die Lösungs-NMR-Spektroskopie als Methode der Wahl zur Charakterisierung transienter Konformationszustände7herauskristallisiert. Zusammen mit diesen Experimenten können Störungen wie Temperatur, pH-Wert oder chemische Denaturierungsmittel eingeführt werden, um die relative Population von konformationsreicheren Substaten zu erhöhen. In ähnlicher Weise können Proteingleichgewichte auch durch Anwendung eines hohen hydrostatischen Drucks gestört werden. Abhängig von der Größenordnung der Volumenänderung, die mit den entsprechenden Konformationsänderungen verbunden ist, kann ein Druckanstieg um einige hundert bis einige tausend bar einen höheren Energiezustand signifikant stabilisieren oder dazu führen, dass sich ein Protein vollständig entfaltet8,9,10. Protein-NMR-Spektren zeigen typischerweise zwei Arten von Veränderungen mit hydrostatischem Druck: (i) chemische Verschiebungsänderungen und (ii) Änderungen der Spitzenintensität. Chemische Verschiebungsänderungen spiegeln Veränderungen an der Proteinoberflächen-Wasser-Grenzfläche und/oder lokale Kompression der Proteinstruktur auf einer schnellen Zeitskala (relativ zur NMR-Zeitskala)wider 11. Crosspeaks, die große nichtlineare chemische Verschiebungen aufweisen, können auf das Vorhandensein von konformationsreicheren Zuständen hinweisen12,13. Auf der anderen Seite deuten Änderungen der Spitzenintensität auf große Konformationsübergänge auf einer langsamen Zeitskala hin, wie z. B. Veränderungen in gefalteten / entfalteten Zustandspopulationen. Das Vorhandensein von Faltungszwischenprodukten oder höheren Energiezuständen kann aus großen Variationen in der Größe der Volumenänderung bei der Entfaltung nachgewiesen werden, gemessen für verschiedene Rückstände eines bestimmten Proteins14,15,16,17. Basierend auf unserer Erfahrung zeigen selbst kleine Proteine, die typischerweise als Zwei-Zustands-Ordner klassifiziert werden, ungleichmäßige Reaktionen auf Druck, was nützliche Informationen über ihre lokale Faltungsstabilität liefert. Hier wird ein Protokoll zur Erfassung und Analyse der Amid-Spitzenintensität und der 1H chemischen Verschiebungen der Druckabhängigkeit beschrieben, wobei als Modellprotein das isolierte RNA-Erkennungsmotiv 2 (RRM2) des heterogenen kernen Ribonukleoproteins A1 (hnRNPA1) verwendet wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie beschreibt ein Protokoll, das implementiert wurde, um die strukturellen und thermodynamischen Reaktionen von Proteinen auf Druckstörungen zu untersuchen. Die hier auf RRM2 aufgezeichneten Hochdruckexperimente zeigen, dass große Variationen derΔV-U-Werte, die auf eine nicht vollständig kooperative Entfaltung hinweisen, in einem relativ kleinen Einzeldomänenprotein gefunden werden können. Ein ähnliches Bild ergibt sich aus der Analyse von 1H chemischen Verschiebungsänderungen unte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Roy J. Carver Charitable Trust an Julien Roche unterstützt. Wir danken J. D. Levengood und B. S. Tolbert für die freundliche Bereitstellung der RRM2-Probe.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
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