Hogedruk NMR-experimenten voor het detecteren van eiwitarme conformatietoestanden
Summary
We geven een gedetailleerde beschrijving van de stappen die nodig zijn om een hogedrukcel samen te stellen, hogedruk NMR-experimenten op te zetten en op te nemen en ten slotte zowel piekintensiteit als chemische verschuivingsveranderingen onder druk te analyseren. Deze experimenten kunnen waardevolle inzichten opleveren in de vouwroutes en structurele stabiliteit van eiwitten.
Abstract
Hogedruk is een bekende perturbatiemethode die kan worden gebruikt om bolvormige eiwitten te destabiliseren en eiwitcomplexen op een omkeerbare manier te dissociëren. Hydrostatische druk drijft thermodynamische evenwichten naar de toestand (en) met het lagere molaire volume. Toenemende druk biedt daarom de mogelijkheden om de stabiliteit van bolvormige eiwitten en de oligomerisatie-evenwichten van eiwitcomplexen fijn af te stemmen. Hogedruk NMR-experimenten maken een gedetailleerde karakterisering mogelijk van de factoren die de stabiliteit van bolvormige eiwitten, hun vouwmechanismen en oligomerisatiemechanismen regelen door het fijnstabiliteitsafstemmingsvermogen van drukdoorturbatie te combineren met de locatieresolutie die wordt geboden door oplossing NMR-spectroscopie. Hier presenteren we een protocol om de lokale vouwstabiliteit van een eiwit te onderzoeken via een reeks 2D 1H-15N-experimenten geregistreerd van 1 bar tot 2,5 kbar. De stappen die nodig zijn voor de verwerving en analyse van dergelijke experimenten worden geïllustreerd met gegevens die zijn verkregen over het RRM2-domein van hnRNPA1.
Introduction
Het is al lang erkend dat hoger-energetische, dunbevolkte conformatietoestanden van eiwitten en eiwitcomplexen een sleutelrol spelen in veel biologische routes1,2,3. Dankzij experimenten op basis van onder andere Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5en dark-state exchange saturation transfer (DEST)6 pulssequenties , is oplossing NMR-spectroscopie naar voren gekomen als een voorkeursmethode voor het karakteriseren van voorbijgaande conformatietoestanden7. Samen met deze experimenten kunnen verstoringen zoals temperatuur, pH of chemische denaturatiemiddelen worden geïntroduceerd om de relatieve populatie van hogere energie conformatiesubstaten te vergroten. Evenzo kunnen eiwitevenwichten ook worden verstoord door hoge hydrostatische druk toe te passen. Afhankelijk van de grootte van de volumeverandering geassocieerd met de overeenkomstige conformatieveranderingen, kan een toename van de druk met een paar honderd tot een paar duizend bar een hogere energietoestand aanzienlijk stabiliseren of ervoor zorgen dat een eiwit zich volledig ontvouwt8,9,10. Eiwit NMR-spectra vertonen doorgaans twee soorten veranderingen met hydrostatische druk: (i) chemische verschuivingsveranderingen en (ii) piekintensiteitsveranderingen. Chemische verschuivingsveranderingen weerspiegelen veranderingen op het eiwitoppervlak-waterinterface en/of lokale compressie van de eiwitstructuur op een snelle tijdschaal (ten opzichte van NMR-tijdschaal)11. Crosspeaks die grote niet-lineaire chemische verschuivingen vertonen, kunnen wijzen op de aanwezigheid van hogere energieconformatietoestanden12,13. Aan de andere kant wijzen piekintensiteitsveranderingen op belangrijke conformatieovergangen op een langzame tijdschaal, zoals veranderingen in gevouwen / ongevouwen toestandspopulaties. De aanwezigheid van vouwtussenproducten of hogere energietoestanden kan worden gedetecteerd aan de hand van grote variaties in de grootte van de volumeverandering bij het uitvouwen, gemeten voor verschillende residuen van een bepaald eiwit14,15,16,17. Op basis van onze ervaring vertonen zelfs kleine eiwitten die meestal worden geclassificeerd als tweestatenmappen niet-uniforme reacties op druk, wat nuttige informatie biedt over hun lokale vouwstabiliteit. Hier wordt een protocol beschreven voor de verwerving en analyse van amidepiekintensiteit en 1H chemische verschuivingen drukafhankelijkheid, met als modeleiwit het geïsoleerde RNA-herkenningsmotief 2 (RRM2) van het heterogene nucleaire ribonucleoproteïne A1 (hnRNPA1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie beschrijft een protocol dat is geïmplementeerd om eiwit structurele en thermodynamische reacties op drukperturbatie te onderzoeken. De hogedrukexperimenten die hier op RRM2 zijn geregistreerd, tonen aan dat grote variaties in ΔV U-waarden, indicatief voor niet-volledig coöperatieve ontplooiing, kunnen worden gevonden in een relatief klein enkel domein eiwit. Een vergelijkbaar beeld komt naar voren uit de analyse van 1H chemische verschuivingsveranderingen onder druk. Opgemerkt moet wo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Roy J. Carver Charitable Trust aan Julien Roche. Wij danken J. D. Levengood en B. S. Tolbert voor het verzorgen van het RRM2-monster.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins’ behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. . Sparky 3. , (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
