تجارب NMR عالية الضغط للكشف عن حالات المطابقة منخفضة البروتين
Summary
نحن نقدم وصفا مفصلا للخطوات المطلوبة لتجميع خلية الضغط العالي، وإعداد وتسجيل تجارب NMR عالية الضغط، وأخيرا تحليل كل من كثافة الذروة والتغيرات التحول الكيميائي تحت الضغط. يمكن أن توفر هذه التجارب رؤى قيمة في مسارات قابلة للطي والاستقرار الهيكلي للبروتينات.
Abstract
الضغط العالي هو طريقة اضطراب معروفة يمكن استخدامها لزعزعة استقرار البروتينات الكروية ومجمعات البروتين التفكك بطريقة قابلة للعكس. يدفع الضغط الهيدروستاتيكي الاعتدال الديناميكي الحراري نحو الحالة (الدول) مع انخفاض حجم الضرس. زيادة الضغط يوفر، لذلك، الفرص لضبط بدقة استقرار البروتينات كروية والاعتدال أوليغوميرين من مجمعات البروتين. تسمح تجارب NMR عالية الضغط بإجراء توصيف مفصل للعوامل التي تحكم استقرار البروتينات الكروية ، وآليات طيها ، وآليات احتكار القلة من خلال الجمع بين الاستقرار الدقيق في ضبط قدرة اضطراب الضغط ودقة الموقع التي يوفرها التحليل الطيفي NMR الحل. هنا نقدم بروتوكولا للتحقيق في الاستقرار للطي المحلية من البروتين عن طريق مجموعة من التجارب 2D 1H-15N سجلت من 1 شريط إلى 2.5 كيلوبار. وتتجلى الخطوات اللازمة لاكتساب هذه التجارب وتحليلها في البيانات التي تم الحصول عليها في مجال RRM2 التابع ل hnRNPA1.
Introduction
منذ فترة طويلة من المسلم به أن الطاقة العالية، والدول تشكيلية قليلة السكان من البروتينات ومجمعات البروتين تلعب دورا رئيسيا في العديد من المسارات البيولوجية1،2،3. بفضل التجارب القائمة على كار بورسيل-ميبوم-جيل (CPMG)4، نقل تشبع التبادل الكيميائي (CEST)5، ونقل تشبع الصرف في الحالة المظلمة (DEST)6 تسلسلات نبض (من بين أمور أخرى) ، ظهر التحليل الطيفي NMR كحل كطريقة للاختيار لوصف الحالات التوافقية العابرة7. جنبا إلى جنب مع هذه التجارب، يمكن إدخال الاضطرابات مثل درجة الحرارة، ودرجة الحموضة، أو التسخين الكيميائي لزيادة عدد السكان النسبي من الدول الفرعية أعلى تشكيل الطاقة. وبالمثل، يمكن أيضا أن تكون مضطربة توازن البروتين عن طريق تطبيق الضغط الهيدروستاتيكي عالية. اعتمادا على حجم تغيير حجم المرتبطة التغيرات المطابقة تشكيلية, زيادة الضغط من قبل بضع مئات إلى بضعة آلاف من القضبان يمكن أن تستقر بشكل كبير في حالة طاقة أعلى أو يسبب البروتين تتكشف تماما8,9,10. عادة ما تعرض أطياف البروتين NMR نوعين من التغييرات مع الضغط الهيدروستاتيكي: (1) تغييرات التحول الكيميائي و (2) تغيرات كثافة الذروة. تعكس تغييرات التحول الكيميائي التغيرات في واجهة المياه السطحية البروتينية و / أو الضغط المحلي لهيكل البروتين على مقياس زمني سريع (بالنسبة إلى مقياس الوقت NMR)11. Crosspeaks عرض التحولات الكيميائية غير الخطية الكبيرة الاعتماد على الضغط يمكن أن تشير إلى وجود أعلى الدول تشكيل الطاقة12،13. ومن ناحية أخرى، تشير التغيرات في كثافة الذروة إلى تحولات تشكيلية رئيسية على نطاق زمني بطيء، مثل التغيرات في عدد سكان الولايات المطوية/التي تتكشف. يمكن الكشف عن وجود وسيطات قابلة للطي أو حالات طاقة أعلى من اختلافات كبيرة في حجم تغير الحجم عند التكشف قياسها لبقايا مختلفة من بروتين معين14،15،16،17. استنادا إلى تجربتنا، حتى البروتينات الصغيرة التي تصنف عادة على أنها مجلدات من دولتين تظهر استجابات غير موحدة للضغط، والتي توفر معلومات مفيدة حول استقرارها للطي المحلي. وصف هنا هو بروتوكول لاكتساب وتحليل كثافة الذروة وسط و 1H التحولات الكيميائية الاعتماد على الضغط، وذلك باستخدام بروتين نموذج التعرف على الحمض النووي الريبي معزولة عزر 2 (RRM2) من ريبونوكليوبروتين النووية غير متجانسة A1 (hnRNPA1).
Protocol
Representative Results
Discussion
تفصل هذه الدراسة بروتوكولا تم تنفيذه للتحقيق في استجابات البنيوية والديناميكا الحرارية للبروتين لاضطرابات الضغط. تثبت تجارب الضغط العالي المسجلة هنا على RRM2 أن الاختلافات الكبيرة في قيم ΔVU ، مما يدل على تطور غير تعاوني بالكامل ، يمكن العثور عليها في بروتين مجال واحد صغير نسبيا. وتنب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بأموال من صندوق روي ج. كارفر الخيري لجوليان روش. نشكر ج. د. ليفينغود وب. س. تولبرت على التكرم بتقديم عينة RRM2.
Materials
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins’ behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. . Sparky 3. , (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
