C. elegans Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Motor Bozukluğun Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, C. elegans amyotrofik lateral skleroz modellerinde hafif, orta ve şiddetli motor bozukluk arasında ayrım yapmak için iki hassas tahlil, C. elegans suşları için genel yarar ile değiştirilmiş hareketlilik ile açıklanmaktadır.
Abstract
Nörodejeneratif hastalık amyotrofik lateral skleroz (ALS), zamanla kötüleşen kas zayıflığı ve motor bozukluk eşliğinde motor nöronların ilerleyici kaybına sahiptir. Hastaların bir alt kümesi için ALS’nin genetik sürücülerinin belirlenmesinde önemli ilerlemeler elde edilmiş olsa da, vakaların çoğunda bilinmeyen bir etiyoloji vardır. Ayrıca, motor nöron disfonksiyonu ve dejenerasyonun altında kalan mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır; bu nedenle, bu süreçleri incelemek için temsili modeller geliştirmek ve karakterize etmek için devam eden bir ihtiyaç vardır. Caenorhabditis elegans , laboratuvar ortamında incelenen iki birincil hareket paradigması ile hareketlerini çevrelerinin fiziksel kısıtlamalarına uyarlayabilir – katı bir yüzeyde sürünür ve sıvı içinde yüzer. Bunlar duyum, motor nöronlar ve kaslar arasında karmaşık bir etkileşimi temsil eder. C. ELEGANS ALS modelleri bu hareket paradigmalarından birinde veya her ikisinde de bozulma oluşturabilir. Bu protokol, C. elegans’taki hareketliliği değerlendirmek için iki hassas tahlil açıklar: katı bir yüzeyde gezinmeyi ölçen optimize edilmiş bir radyal hareketlilik testi ve sıvıda yüzmeyi izlemek ve analiz etmek için otomatik bir yöntem (kırbaçlama). ALS modellerinin taban çizgisi motor bozukluğunun karakterizasyonuna ek olarak, bu tahliller fenotiplerin genetik veya küçük molekül müdahalelerinden baskılanmasını veya arttırılmasını tespit edebilir. Bu nedenle, bu yöntemler ALS modellerini ve değiştirilmiş hareketlilik gösteren herhangi bir C. elegans suşunu incelemek için yardımcı programlara sahiptir.
Introduction
Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), motor nöronlar üzerinde özel bir etkisi olan zayıflatıcı, yaşlanmaya bağlı bir nörodejeneratif hastalıktır. Hastalık, beyin ve omurilikte motor nöron kaybı ve ilerleyici motor bozukluk içerir. Bu, tipik olarak tanıdan sonraki 3-5 yıl içinde majör fonksiyonel sakatlık ve erken ölümle sonuçlanır1. En az 38 gendeki mutasyonlar ALS’ye neden olabilir; Bununla birlikte, ALS’li hastaların çoğu nöronlarda ve glial hücrelerde birincil patoloji olarak TDP-43 proteininin her yerde bulunan inklüzyonlarını biriktirir2,3,4. ALS in vivo’ya neden olan veya katkıda bulunan temel mekanizmaları incelemek için bir dizi hayvan modeli geliştirilmiştir (in5’te gözden geçirilmiştir). C. elegans’ta bu modeller ALS’ye neden olan genlerin homologlarında genetik fonksiyon kaybı mutasyonlarını veya insan ALS genlerinin transgenik ekspresyonunu içerir. C. elegans’ta ALS modellemenin sayısız avantajı vardır. C. elegans, farklılaşmış bir sinir sistemine, iyi karakterize edilmiş davranış paradigmalarına ve insanlara önemli genetik homolojiye sahip çekilebilir basit bir hayvandır6,7. Güçlü genom düzenleme yetenekleri, nörodejenerasyon in vivo floresan muhabirleri, RNAi tarama paradigmaları, çekişli genetik ve yerleşik davranışsal ve fenotipik tahliller de dahil olmak üzere C. elegans ile çalışmak için birçok araç mevcuttur. C. ELEGANS ALS modelleri, çözünmeyen protein birikimi, nörodejenerasyon ve erken ölüm de dahil olmak üzere insan hastalığının yönlerini yeniden özetler8,9. Ayrıca, hem emekleme hem de yüzme davranışlarında rahatsızlık içeren motor disfonksiyon birçok C. elegans ALS modelinde mevcuttur.
Bu protokol , C. elegans motor fenotiplerini karakterize etmek için iki yöntemi açıklar: katı bir yüzeyde gezinmeyi değerlendirmek için radyal hareketlilik testi ve WormLab otomatik izleme ve analizini kullanarak sıvıda yüzmenin (kırbaçlama) değerlendirilmesi. Motor açıklarını karakterize etmek için bu hassas yöntemler, şiddetin karşılaştırılmasına izin verir ve motor fenotiplerin baskılanması ve geliştirilmesini ölçmek için araçlar sunar. Radyal hareketlilik testi, solucan popülasyonları arasında sürünen hareketlilikteki (katı bir yüzeydeki sinüzoidal hareket) farklılıkları ölçen testtir. Bu tahlil, solucanları bir tabağa tek bir yere yerleştirerek ve belirli bir süre sonra son konumlarını işaretleyerek C. elegans doğal uyarılmamış keşif davranışından yararlanır10. Alternatif olarak, sıvı (kırbaçlama) testlerinde yüzmek, belirli bir süre boyunca bireysel solucanların vücut bükülmelerini sayar. Vücut virajlarının insan gözüyle manuel olarak sayılması zaman yoğundur ve tipik olarak deneyciler arasında önemli bir değişkenlik gösterir. Bilgisayar destekli otomatik izleme ve analizin kullanılması, bu değişkenliğin çoğunu ortadan kaldırabilir. ALS modellerinin taban çizgisi motor bozukluğunun karakterizasyonuna ek olarak, hem radyal hareketlilik hem de yüzme tahlilleri, genetik veya küçük molekül müdahalelerinden farklı lokomotor fenotiplerinin modülasyonunu tespit edebilir. Bu yöntemler, ALS modellerini ve değiştirilmiş hareketlilik gösteren herhangi bir C. elegans suşunu incelemek için yardımcı programlara sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Radyal hareketlilik:
Bu tahlilin çözünürlüğü zaman değişkeni değiştirilerek kolayca kontrol edilir. Sürenin artırılması, şiddetli fenotiplere sahip hayvanlar arasındaki farklılıkları gözlemlemeyi kolaylaştırır, böylece ince farklılıkları tanımlar. Bununla birlikte, bu test yer değiştirmeyi ölçtüğünden, tahlil süresi çok uzun uzatılırsa, N2 gibi normal hareketliliği olan hayvanlar plakanın kenarlarına seyahat eder ve yiyecek arama davranışı geriye doğru iz sürmeye yol açar. Bu, kat edilen mesafenin ölçümünü yapay olarak azaltacaktır. Çok uzun olan zaman aralıkları, özellikle daha az şiddetli motor fenotipleri olan hayvanlar arasındaki suşlar arasındaki farklılıkların kaybolmasına neden olabilir, çünkü hayvanlar plaka boyunca eşit olarak dağılır. Zaman değişkeninin kısaltılması, daha aktif solucanların plakanın kenarlarını bulmasını önleyecektir. Bu yöntem, her solucan için kat edilen toplam mesafeyi izlemez, ancak her solucan için kat edilen mesafeyi plakanın merkezinden doğrusal bir mesafeye sıkıştırır. Bu nedenle, doğası gereği tek tek solucanların toplam iz uzunluğunu kaydeden bir yöntemden daha az sağlamdır. Bununla birlikte, radyal locomotion testi çok az araştırmacı eğitimi gerektirir, çoğu solucan laboratuvarında yaygın olarak bulunan nispeten uygun fiyatlı reaktifleri kullanır ve önemli ve tekrarlanabilir sonuçlar üretecek kadar hassastır. Otomatik video izlemeyi tercih eden laboratuvarlar için, gezinme hareketlerini izlemek ve analiz etmek için daha önce çeşitli yöntemler oluşturulmuştur12 veya bu makaledeki yüzme tahlilleri için kullanılan yazılım parametreleri tarama algılama ve analizine izin vermek için değiştirilebilir.
Bu deney genellikle üç taraflı bağımsız çoğaltmalarda yapılır ve çoğaltma başına 30-40 solucan kümesi vardır. Her çoğaltma, plaka başına 15-20 solucan ile iki farklı 100 mm veya 150 mm plakaya bölünür. Plaka başına önerilenden daha fazla solucan kullanmak, verimli bir şekilde puan almanın zor olmasını sağlayabilir. 90+ puan alan toplam sayı, hafif, orta veya şiddetli hareketlilik bozukluğu için önem oluşturmak için yeterince güçlendirilmiştir. Puanlanan suşlar arasındaki zamanlama ile tutarlı olmak doğruluk ve tekrarlanabilirlik için gereklidir. 30 dakika genellikle insan mutant TDP-43’ü ifade eden transgenik suşlar gibi orta ila şiddetli fenotipler arasında vahşi tip solucanlara kıyasla farklar oluşturacak kadar uzundur (Şekil 4). Zaman değişkeni uzatılacaksa, plakanın boyutunun 100 mm’den 150 mm’ye çıkarılması da önerilir. Sıcaklık ve nem gibi çevresel faktörler, tipik olarak ortam odası sıcaklığında gerçekleştirilen bu tahlilleri etkileyebilir, bu nedenle çoğaltmalar arasında karşılaştırma yaparken her zaman vahşi tip (N2) kontrolü kullanmak önemlidir. Ek olarak, bu test, sıvıda normal yüzme davranışı sergilemeyen bazı suşların hareketliliğini ölçebilir (kırbaçlama), yüzme testine yararlı bir tamamlayıcıdır.
Yüzme tahlil:
Solucan yüzmesinin izlenmesini ve analizini otomatikleştirmek için görüntüleme ve edinme sisteminin kullanılması, titiz ve tarafsız verilere izin verir. Bununla birlikte, denemenin ilk kurulumu sırasında örnekler arasında kontrol edilmesi gereken birkaç faktör vardır. Bunlar, kayda başlamadan önce sıvıya alışma süresini, ortam koşullarını (örneğin sıcaklık, nem) ve tutarlı ışık ve kayıt ayarlarını içerir. Kayıt aşamasında, plakalar arasındaki değişkenliği azaltmaya yardımcı olan çeşitli özellikler vardır. Bunlar arasında, video kaydına plakalar arasında tutarlı hale getiren entegre bir parçaya monte kamera ve parlak alan aşaması, kayıt sırasında yansımaları, parlamayı ve hava hareketlerini önleyen sahne alanının etrafında koruma ve solucanları güvenilir bir şekilde algılayan ve video sonrası işlemdeki parçaların manuel olarak düzeltilmesini sağlayan sağlam bir yazılım paketi bulunur. Bu protokolde, solucanlı 35 mm’lik bir plakanın videoları 1 dakika boyunca kaydedilir ve daha sonra yazılım paketi kullanılarak işlenir. İşlemden sonra, izlerin manuel olarak düzeltilmesi, solucan davranışlarının şaşırtıcı izleme hataları olmadan doğru bir şekilde kaydedilmesini sağlar. Dönüş sayısı ve izleme süresi verileri, son okuma olarak dakika başına dönüşleri belirlemek için kullanılır. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, her biri 40-50 hayvan puanlanmış en az 3 bağımsız çoğaltma deneyi üzerinden veri toplanır ve toplam son hayvan sayısı 120-150’ye ulaşır. Bu sayı, yüzme davranışındaki küçük farklılıkları kontrol solucanlarından ayırt etmek için yeterlidir. Bazı solucanların yüzerek test edilemeyecek kadar ciddi motor açıkları vardır. Örneğin, beklenen dayak tepkisini yerine sıvı bir orta kıvrılmaya yerleştirilen hayvanlar, bu tahlil bu hareketleri doğru bir şekilde kaydetmez ve radyal hareketlilik gibi başka bir hareket testi bu hareketlilik kusurlarını daha iyi yakalayabilir. Sağlanan protokol ticari olarak kullanılabilen bir görüntüleme sistemi kullanır (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosu’na bakın), ancak diğer solucan izleme sistemleri benzer bir yardımcı program sağlayabilir ve bazıları açık kaynak12’dir. Daha önce yayınlanan yöntemler solucan kırbaçlamanın manuel puanlamasını açıklar13. Otomatik analiz her bir solucan için bir dizi ölçüm üretirken, dakikada thrashes ile ölçülen vücut bükümlerinin tespiti, deneyler ve izler arasında, solucan kırbaçlarının gözle geleneksel puanlamasıyla tutarlı sonuçlar sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yararlı yorum ve öneriler için yorumculara teşekkür ederiz. Aleen Saxton, Brandon Henderson ve Jade Stair’e olağanüstü teknik yardım için teşekkür ederiz. Brian Kraemer ve Rebecca Kow’a bu tahlillerin geliştirilmesine yardımları için teşekkür ederiz. Bu malzeme, VA Puget Ses Sağlık Sistemi’ndeki kaynaklar ve tesislerin kullanımı ile desteklenen çalışmaların bir sonucudur. Bu çalışma Amerika Birleşik Devletleri’nden (ABD) bir hibe ile desteklendi. Gazi İşleri Bakanlığı (VA) Biyomedikal Laboratuvar Araştırma ve Geliştirme Servisi [N.F.L.’ye Liyakat İnceleme Hibe #I01BX004044]
Materials
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
| Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
| Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
| Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
| Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
| Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
| Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
| Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
| ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
| M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
| p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
| p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
| Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
| WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |
References
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).
- Arai, T., et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Mejzini, R., et al. ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now. Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).
- Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. ALS/FTLD: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).
- Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).
- Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).
- Robatzek, M., Thomas, J. H. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network. Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
- Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. . WormBook. , 1551 (2006).
