Оценка двигательных нарушений в моделях C. elegans бокового амиотрофического склероза
Summary
Этот протокол описывает два чувствительных анализа для различения легких, умеренных и тяжелых двигательных нарушений у моделей бокового амиотрофического склероза C. elegans с общей полезностью для штаммов C. elegans с измененной подвижностью.
Abstract
Нейродегенеративное заболевание боковой амиотрофический склероз (БАС) характеризуется прогрессирующей потерей двигательных нейронов, сопровождающейся мышечной слабостью и двигательными нарушениями, которые ухудшаются со временем. Хотя значительные успехи были достигнуты в определении генетических драйверов БАС для подмножества пациентов, большинство случаев имеют неизвестную этиологию. Кроме того, механизмы, лежащие в основе дисфункции и дегенерации двигательных нейронов, недостаточно изучены; поэтому существует постоянная необходимость в разработке и характеристике репрезентативных моделей для изучения этих процессов. Caenorhabditis elegans могут адаптировать свое движение к физическим ограничениям окружающей среды, с двумя основными парадигмами движения, изученными в лабораторной среде – ползание по твердой поверхности и плавание в жидкости. Они представляют собой сложное взаимодействие между ощущениями, двигательными нейронами и мышцами. Модели ALS C. elegans могут демонстрировать нарушения в одной или обеих из этих парадигм движения. Этот протокол описывает два чувствительных анализа для оценки подвижности у C. elegans: оптимизированный радиальный локомоционный анализ, измеряющий ползание по твердой поверхности, и автоматизированный метод отслеживания и анализа плавания в жидкости (трэшинг). В дополнение к характеристике базовых двигательных нарушений моделей БАС, эти анализы могут обнаруживать подавление или усиление фенотипов в результате генетических или низкомолекулярных вмешательств. Таким образом, эти методы имеют полезность для изучения моделей БАС и любого штамма C. elegans , который проявляет измененную подвижность.
Introduction
Боковой амиотрофический склероз (БАС) является изнурительным, связанным со старением нейродегенеративным заболеванием с особым воздействием на двигательные нейроны. Заболевание характеризуется потерей двигательных нейронов в головном и спинном мозге и прогрессирующими двигательными нарушениями. Это приводит к значительной функциональной инвалидности и преждевременной смерти, как правило, в течение 3-5 лет после постановки диагноза1. Мутации по крайней мере в 38 генах могут вызвать БАС; однако у большинства пациентов с БАС накапливаются убиквитинированные включения белка TDP-43 в качестве первичной патологии в нейронах и глиальных клетках2,3,4. Был разработан ряд моделей на животных для изучения основных механизмов, вызывающих или способствующих БАС in vivo (рассмотрено в 5). У C. elegans эти модели включают генетические мутации потери функции в гомологах генов, вызывающих БАС, или трансгенную экспрессию генов БАС человека. Существует множество преимуществ моделирования БАС у C. elegans. C. elegans — это сговорчивое простое животное с дифференцированной нервной системой, хорошо охарактеризованными поведенческими парадигмами и значительной генетической гомологией для человека6,7. Существует множество инструментов для работы с C. elegans, включая надежные возможности редактирования генома, флуоресцентные репортеры нейродегенерации in vivo, парадигмы скрининга РНКи, поддающуюся обработке генетику и установленные поведенческие и фенотипические анализы. Модели C. elegans ALS рекапитулируют аспекты заболеваний человека, включая накопление нерастворимого белка, нейродегенерацию и раннюю смерть8,9. Кроме того, двигательная дисфункция, характеризующаяся нарушением как ползания, так и плавания, присутствует во многих моделях C. elegans ALS.
Этот протокол описывает два метода для характеристики двигательных фенотипов C. elegans : радиальный локомоционный анализ для оценки ползания по твердой поверхности и оценку плавания в жидкости (трэшинг) с использованием автоматизированного отслеживания и анализа WormLab. Эти чувствительные методы для характеристики двигательного дефицита позволяют сравнивать тяжесть и предлагают инструменты для измерения подавления и усиления двигательных фенотипов. Анализ радиальной локомоции количественно определяет различия в подвижности ползания (синусоидальное движение по твердой поверхности) среди популяций червей. Этот анализ использует преимущества естественного нестимулированного исследовательского поведения C. elegans , помещая червей в одном месте на пластине и отмечая их окончательное местоположение через заданный период времени10. В качестве альтернативы, плавая в жидкости (трэшинг), анализы подсчитывают изгибы тела отдельных червей в течение определенного периода времени. Ручной подсчет изгибов тела человеческим глазом занимает много времени и, как правило, демонстрирует значительную изменчивость между экспериментаторами. Использование автоматизированного отслеживания и анализа с помощью компьютеров может устранить большую часть этой изменчивости. В дополнение к характеристике базовых двигательных нарушений моделей БАС, как радиальная локомоция, так и плавание могут обнаруживать модуляцию различных локомоторных фенотипов от генетических или низкомолекулярных вмешательств. Эти методы полезны для изучения моделей БАС и любого штамма C. elegans , который проявляет измененную подвижность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Радиальная локомоция:
Разрешение этого анализа легко контролируется путем изменения временной переменной. Увеличение продолжительности времени облегчает наблюдение различий между животными с тяжелыми фенотипами, тем самым выявляя тонкие различия. Однако, поскольку этот анализ измеряет смещение, если время анализа слишком велико, животные с нормальной подвижностью, такие как N2, будут перемещаться к краям пластины, а поведение корма приведет к обратному отслеживанию. Это позволит искусственно уменьшить измерение пройденного расстояния. Слишком длительные периоды времени могут привести к исчезновению различий между штаммами, особенно между животными с менее тяжелыми двигательными фенотипами, поскольку животные становятся равномерно распределенными по пластине. Сокращение переменной времени помешает более активным червям найти края пластины. Этот метод не отслеживает общее расстояние, пройденное для каждого червя, но сжимает расстояние, пройденное для каждого червя, на линейное расстояние от центра пластины. Таким образом, он по своей сути менее надежен, чем метод, который записывает общую длину трека отдельных червей. Тем не менее, анализ радиальной локомоции требует очень небольшой подготовки исследователей, использует относительно доступные реагенты, которые обычно доступны в большинстве лабораторий червей, и достаточно чувствителен, чтобы получить значительные и воспроизводимые результаты. Для лабораторий, которые предпочитают автоматизированное отслеживание видео, ранее было создано несколько методов для отслеживания и анализа ползучих движений12, или параметры программного обеспечения, используемые для анализа плавания в этой статье, могут быть изменены, чтобы позволить обнаружение и анализ ползания.
Этот эксперимент обычно проводится в трех независимых репликах, с набором из 30-40 червей на реплику. Каждая реплика разделена на две разные пластины 100 мм или 150 мм, с 15-20 червями на пластину. Использование большего количества червей, чем рекомендуется на тарелку, может затруднить эффективную оценку. Общее число баллов 90+ достаточно мощно, чтобы установить значимость для легких, умеренных или тяжелых нарушений моторики. Соответствие времени между оцененными штаммами имеет важное значение для точности и воспроизводимости. 30 минут, как правило, достаточно, чтобы установить различия между умеренными и тяжелыми фенотипами, такими как трансгенные штаммы, экспрессирующие мутантный TDP-43 человека, по сравнению с червями дикого типа (рисунок 4). Если переменная времени будет расширена, желательно также увеличить размер пластины со 100 мм до 150 мм. Факторы окружающей среды, такие как температура и влажность, могут влиять на этот анализ, который обычно проводится при комнатной температуре окружающей среды, поэтому важно всегда использовать контроль дикого типа (N2) при сравнении реплик. Кроме того, этот анализ может измерять подвижность некоторых штаммов, которые не проявляют нормального плавательного поведения в жидкости (трэшинг), что делает его полезным дополнением к плавательному анализу.
Анализ плавания:
Использование системы визуализации и сбора для автоматизации отслеживания и анализа плавания червей позволяет получать точные и непредвзятые данные. Тем не менее, есть несколько факторов при первоначальной настройке эксперимента, которые необходимо контролировать между образцами. К ним относятся время акклиматизации к жидкости перед началом записи, условия окружающей среды (т. Е. Температура, влажность) и постоянные настройки освещения и записи. На этапе записи есть несколько функций, которые помогают уменьшить изменчивость между пластинами. К ним относятся встроенная камера, установленная на треке, и сцена яркого поля, которая делает запись видео согласованной между пластинами, экранирование вокруг сцены, которое предотвращает отражения, блики и движения воздуха во время записи, а также надежный программный пакет, который надежно обнаруживает червей и позволяет вручную корректировать треки в постобработке видео. В этом протоколе видео 35-мм пластины с червями записываются в течение 1 минуты, а затем обрабатываются с помощью программного пакета. После обработки ручная коррекция треков гарантирует, что поведение червей записывается точно, не смешивая ошибки отслеживания. Данные о количестве поворотов и длительности трека используются для определения оборотов в минуту в качестве окончательного считывания. Чтобы обеспечить воспроизводимость, данные собираются в течение как минимум 3 независимых экспериментов по репликации, каждый с 40-50 животными, чтобы достичь общего конечного числа животных 120-150. Этого числа достаточно, чтобы отличить небольшие различия в плавательном поведении от контрольных червей. Некоторые черви имеют двигательный дефицит, слишком серьезный, чтобы его можно было поймать с помощью плавательных анализов. Например, если животные помещены в завиток жидкой среды вместо того, чтобы выполнять ожидаемую реакцию на удар, этот анализ не будет точно записывать эти движения, и другой анализ движения, такой как радиальная локомоция, может лучше уловить эти дефекты моторики. Предоставляемый протокол использует коммерчески доступную систему визуализации (см. Таблицу материалов для получения более подробной информации ), но другие системы отслеживания червей могут предоставлять аналогичную утилиту, причем некоторые из них имеют открытый исходный код12. Ранее опубликованные методы описывают ручную оценку червячного трэшинга13. В то время как автоматизированный анализ дает ряд показателей для каждого отдельного червя, обнаружение изгибов тела, которые измеряются в трэшах в минуту, обеспечивает последовательные результаты между экспериментами и отслеживается хорошо с обычным подсчетом ударов червей на глаз.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим рецензентов за полезные комментарии и предложения. Мы благодарим Алин Сакстон, Брэндона Хендерсона и Джейд Стэйр за выдающуюся техническую помощь. Мы благодарим Брайана Кремера и Ребекку Коу за помощь в разработке этих анализов. Этот материал является результатом работы, подкрепленной ресурсами и использованием объектов в системе здравоохранения VA Puget Sound. Эта работа была поддержана грантом США (США) Департамент по делам ветеранов (VA) Служба биомедицинских лабораторных исследований и разработок [Грант на рассмотрение заслуг #I01BX004044 n.F.L.]
Materials
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
| Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
| Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
| Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
| Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
| Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
| Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
| Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
| ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
| M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
| p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
| p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
| Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
| WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |
References
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).
- Arai, T., et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Mejzini, R., et al. ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now. Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).
- Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. ALS/FTLD: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).
- Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).
- Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).
- Robatzek, M., Thomas, J. H. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network. Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
- Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. . WormBook. , 1551 (2006).
