Valutazione della compromissione motoria in modelli di C. elegans di sclerosi laterale amiotrofica
Summary
Questo protocollo descrive due saggi sensibili per discriminare tra compromissione motoria lieve, moderata e grave in modelli di sclerosi laterale amiotrofica di C. elegans , con utilità generale per ceppi di C. elegans , con motilità alterata.
Abstract
La malattia neurodegenerativa sclerosi laterale amiotrofica (SLA) presenta una progressiva perdita di motoneuroni accompagnata da debolezza muscolare e compromissione motoria che peggiora con il tempo. Mentre sono stati fatti notevoli progressi nel determinare i driver genetici della SLA per un sottogruppo di pazienti, la maggior parte dei casi ha un’eziologia sconosciuta. Inoltre, i meccanismi alla base della disfunzione e della degenerazione dei motoneuroni non sono ben compresi; pertanto, vi è una continua necessità di sviluppare e caratterizzare modelli rappresentativi per studiare questi processi. Caenorhabditis elegans può adattare il loro movimento ai vincoli fisici dell’ambiente circostante, con due paradigmi di movimento primari studiati in un ambiente di laboratorio: strisciare su una superficie solida e nuotare nel liquido. Questi rappresentano una complessa interazione tra sensazione, motoneuroni e muscoli. I modelli di C. elegans della SLA possono mostrare compromissione in uno o entrambi questi paradigmi di movimento. Questo protocollo descrive due saggi sensibili per valutare la motilità in C. elegans: un saggio di locomozione radiale ottimizzato che misura la strisciatura su una superficie solida e un metodo automatizzato per tracciare e analizzare il nuoto nel liquido (thrashing). Oltre alla caratterizzazione della compromissione motoria al basale dei modelli di SLA, questi saggi possono rilevare la soppressione o il miglioramento dei fenotipi da interventi genetici o di piccole molecole. Pertanto, questi metodi hanno utilità per studiare i modelli di SLA e qualsiasi ceppo di C. elegans che presenta una motilità alterata.
Introduction
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa debilitante, correlata all’invecchiamento, con un particolare impatto sui motoneuroni. La malattia presenta perdita di motoneuroni nel cervello e nel midollo spinale e compromissione motoria progressiva. Ciò si traduce in grave disabilità funzionale e morte prematura, in genere entro 3-5 anni dalla diagnosi1. Mutazioni in almeno 38 geni possono causare la SLA; tuttavia, la maggior parte dei pazienti con SLA accumula inclusioni ubiquitinate della proteina TDP-43 come patologia primaria nei neuroni e nelle cellule gliali2,3,4. Un certo numero di modelli animali sono stati sviluppati per studiare i meccanismi sottostanti che causano o contribuiscono alla SLA in vivo (esaminato in 5). In C. elegans, questi modelli includono mutazioni genetiche di perdita di funzione negli omologhi di geni che causano la SLA o l’espressione transgenica di geni umani della SLA. Ci sono numerosi vantaggi nel modellare la SLA in C. elegans. C. elegans è un animale semplice trattabile con un sistema nervoso differenziato, paradigmi comportamentali ben caratterizzati e una notevole omologia genetica per l’uomo6,7. Esistono molti strumenti per lavorare con C. elegans, tra cui robuste capacità di editing del genoma, reporter fluorescenti in vivo di neurodegenerazione, paradigmi di screening RNAi, genetica trattabile e saggi comportamentali e fenotipici stabiliti. I modelli di C. elegans della SLA ricapitolano aspetti della malattia umana, tra cui l’accumulo di proteine insolubili, la neurodegenerazione e la morte precoce8,9. Inoltre, la disfunzione motoria con disturbi dei comportamenti di gattonare e nuotare è presente in molti modelli di SLA di C. elegans.
Questo protocollo descrive due metodi per caratterizzare i fenotipi motori di C. elegans : il test di locomozione radiale per valutare il crawling su una superficie solida e la valutazione del nuoto in liquido (thrashing) utilizzando il tracciamento e l’analisi automatizzati di WormLab. Questi metodi sensibili per caratterizzare i deficit motori consentono confronti di gravità e offrono strumenti per misurare la soppressione e i miglioramenti dei fenotipi motori. Il test di locomozione radiale quantifica le differenze nella motilità strisciante (movimento sinusoidale su una superficie solida) tra le popolazioni di vermi. Questo test sfrutta il comportamento naturale di esplorazione non stimolata di C. elegans posizionando i vermi in una singola posizione su una piastra e segnando la loro posizione finale dopo un determinato periodo di tempo10. In alternativa, il nuoto in saggi liquidi (thrashing) conta le curve del corpo dei singoli vermi per un determinato periodo di tempo. Il conteggio manuale delle curve del corpo da parte dell’occhio umano richiede molto tempo e in genere presenta una notevole variabilità tra gli sperimentatori. L’uso del monitoraggio e dell’analisi automatizzati assistiti da computer può eliminare gran parte di tale variabilità. Oltre alla caratterizzazione della compromissione motoria al basale dei modelli di SLA, sia la locomozione radiale che i saggi di nuoto possono rilevare la modulazione di fenotipi locomotori distinti da interventi genetici o di piccole molecole. Questi metodi hanno utilità per studiare i modelli di SLA e qualsiasi ceppo di C. elegans che presenta una motilità alterata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Locomozione radiale:
La risoluzione di questo test è facilmente controllabile modificando la variabile temporale. Aumentare il periodo di tempo rende più facile osservare le differenze tra animali con fenotipi gravi, identificando così sottili differenze. Tuttavia, poiché questo test misura lo spostamento, se il tempo di analisi è esteso troppo a lungo, gli animali con motilità normale, come N2, viaggeranno verso i bordi della piastra e il comportamento di foraggiamento porterà al backtracking. Ciò ridurrà artificialmente la misurazione della distanza percorsa. Periodi di tempo troppo lunghi possono comportare la scomparsa delle differenze tra i ceppi, in particolare tra gli animali con fenotipi motori meno gravi, poiché gli animali diventano uniformemente dispersi attraverso la piastra. Accorciare la variabile temporale impedirà ai vermi più attivi di trovare i bordi della piastra. Questo metodo non tiene traccia della distanza totale percorsa per ciascun verme, ma comprime la distanza percorsa per ciascun verme in una distanza lineare dal centro della piastra. Come tale, è intrinsecamente meno robusto di un metodo che registra la lunghezza totale della traccia dei singoli worm. Tuttavia, il test di locomozione radiale richiede pochissima formazione da parte dei ricercatori, utilizza reagenti relativamente convenienti che sono comunemente disponibili nella maggior parte dei worm lab ed è abbastanza sensibile da produrre risultati significativi e riproducibili. Per i laboratori che preferiscono il monitoraggio video automatizzato, sono stati precedentemente stabiliti diversi metodi per tracciare e analizzare i movimenti di scansione12, oppure i parametri software utilizzati per il test di nuoto in questo documento potrebbero essere modificati per consentire il rilevamento e l’analisi della scansione.
Questo esperimento viene solitamente eseguito in repliche indipendenti triplicate, con un insieme di 30-40 worm per replica. Ogni replica è divisa su due diverse piastre da 100 mm o 150 mm, con 15-20 vermi per piastra. L’uso di più vermi di quelli raccomandati per piatto può rendere difficile segnare in modo efficiente. Un numero totale di 90+ è sufficientemente potenziato per stabilire il significato per la compromissione della motilità lieve, moderata o grave. Essere coerenti con i tempi tra i ceppi valutati è essenziale per l’accuratezza e la riproducibilità. 30 minuti sono generalmente sufficienti per stabilire differenze tra fenotipi da moderati a gravi come i ceppi transgenici che esprimono TDP-43 mutante umano rispetto ai vermi wild-type (Figura 4). Se la variabile temporale verrà estesa, è consigliabile aumentare anche la dimensione della piastra da 100 mm a 150 mm. Fattori ambientali come la temperatura e l’umidità possono influenzare questo test, che viene tipicamente condotto a temperatura ambiente, quindi è importante utilizzare sempre un controllo wild-type (N2) quando si confrontano tra le repliche. Inoltre, questo test può misurare la motilità di alcuni ceppi che non mostrano un normale comportamento di nuoto nel liquido (thrashing), rendendolo un utile complemento al test di nuoto.
Test di nuoto:
L’uso del sistema di imaging e acquisizione per automatizzare il tracciamento e l’analisi del nuoto dei vermi consente di ottenere dati rigorosi e imparziali. Tuttavia, ci sono diversi fattori durante la configurazione iniziale dell’esperimento che devono essere controllati tra i campioni. Questi includono il tempo di acclimatarsi al liquido prima di iniziare la registrazione, le condizioni ambientali (ad esempio, temperatura, umidità) e la luce costante e le impostazioni di registrazione. Nella fase di registrazione, ci sono diverse caratteristiche che aiutano a ridurre la variabilità tra le piastre. Questi includono una telecamera integrata montata su traccia e uno stadio a campo luminoso che rende la registrazione video coerente tra le lastre, schermatura attorno al palco che impedisce riflessi, abbagliamento e movimenti d’aria durante la registrazione e un robusto pacchetto software che rileva in modo affidabile i worm e consente la correzione manuale delle tracce nella post-elaborazione video. In questo protocollo, i video di una piastra da 35 mm con worm vengono registrati per 1 minuto e quindi elaborati utilizzando il pacchetto software. Dopo l’elaborazione, la correzione manuale delle tracce garantisce che i comportamenti dei worm vengano registrati in modo accurato senza confondere gli errori di tracciamento. I dati relativi al conteggio dei turni e alla durata della traccia vengono utilizzati per determinare i turni al minuto come lettura finale. Per garantire la riproducibilità, i dati vengono raccolti su un minimo di 3 esperimenti di replica indipendenti, ciascuno con 40-50 animali valutati, per ottenere un numero finale combinato di animali 120-150. Questo numero è sufficiente per discriminare piccole differenze nel comportamento di nuoto dai vermi di controllo. Alcuni vermi hanno deficit motori troppo gravi per essere catturati da saggi di nuoto. Ad esempio, se gli animali vengono posti in un arricciatura media liquida invece di eseguire la risposta di thrashing prevista, questo test non registrerà accuratamente quei movimenti e un altro test di movimento, come la locomozione radiale, potrebbe catturare meglio quei difetti di motilità. Il protocollo fornito utilizza un sistema di imaging disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali per maggiori dettagli), ma altri sistemi di tracciamento dei worm possono fornire un’utilità simile, con alcuni open source12. I metodi pubblicati in precedenza descrivono il punteggio manuale del worm thrashing13. Mentre l’analisi automatizzata produce una serie di metriche per ogni singolo worm, il rilevamento delle curve del corpo che viene misurato in thrashes al minuto, fornisce risultati coerenti tra esperimenti e tracce ben con il punteggio convenzionale dei worm thrashes a occhio.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i recensori per i commenti e i suggerimenti utili. Ringraziamo Aleen Saxton, Brandon Henderson e Jade Stair per l’eccezionale assistenza tecnica. Ringraziamo Brian Kraemer e Rebecca Kow per l’assistenza nello sviluppo di questi test. Questo materiale è il risultato del lavoro supportato con risorse e l’uso delle strutture del VA Puget Sound Health Care System. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione degli Stati Uniti (USA) Department of Veterans Affairs (VA) Biomedical Laboratory Research and Development Service [Merit Review Grant #I01BX004044 a N.F.L.]
Materials
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
| Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
| Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
| Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
| Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
| Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
| Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
| Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
| ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
| M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
| p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
| p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
| Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
| WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |
References
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