הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב
Summary
פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להפלות בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב, עם תועלת כללית לזני C. elegans , עם תנועתיות שונה.
Abstract
המחלה הנוירודגנרטיבית אמיוטרופית אמיוטרופית טרשת לרוחב (ALS) תכונות אובדן הדרגתי של נוירונים מוטוריים מלווה בחולשת שרירים ופגיעה מוטורית המחמירה עם הזמן. בעוד התקדמות ניכרת נעשתה בקביעת מניעים גנטיים של ALS עבור תת קבוצה של חולים, רוב המקרים יש אטיולוגיה לא ידועה. יתר על כן, המנגנונים שבביסת תפקוד לקוי של נוירון מוטורי והתנוונות אינם מובנים היטב; לכן, יש צורך מתמשך לפתח ולאפיין מודלים מייצגים ללמוד תהליכים אלה. אלגנים Caenorhabditis יכול להתאים את תנועתם לאילוצים הפיזיים של סביבתם, עם שתי פרדיגמות תנועה עיקריות נחקרו בסביבת מעבדה – זוחל על משטח מוצק ושוחה בנוזל. אלה מייצגים יחסי הגומלין מורכבים בין תחושה, נוירונים מוטוריים ושרירים. ג. מודלים אלגנס של ALS יכולים להפגין ליקוי באחת פרדיגמות התנועה האלה או בשתיהן. פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להערכת תנועתיות ב – C. elegans: מתקן קטר רדיאלי ממוטב המודד זחילה על משטח מוצק ושיטה אוטומטית למעקב וניתוח שחייה בנוזל (חבטות). בנוסף לאפיון של פגיעה מוטורית בסיסית של דגמי ALS, בדיקות אלה יכולות לזהות דיכוי או שיפור של הפנוטיפים מהתערבויות גנטיות או קטנות של מולקולות. לכן, שיטות אלה יש תועלת ללימוד מודלים ALS וכל זן C. elegans המציג תנועתיות שונה.
Introduction
טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא מחלה נוירודגנרטיבית מתישה הקשורה להזדקנות עם השפעה מיוחדת על נוירונים מוטוריים. המחלה כוללת אובדן נוירונים מוטוריים במוח ובחוט השדרה ופגיעה מוטורית מתקדמת. התוצאה היא נכות תפקודית גדולה ומוות בטרם עת, בדרך כלל בתוך 3-5 שנים לאחר האבחון1. מוטציות בלפחות 38 גנים יכולות לגרום ל- ALS; עם זאת, רוב החולים עם ALS לצבור בכל מקום תכלילים של חלבון TDP-43 כמו הפתולוגיה העיקרית שלהם נוירונים ותאי גליה2,3,4. מספר מודלים של בעלי חיים פותחו כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים הגורמים או תורמים ALS in vivo (נבדק ב5). ב– C. elegans, מודלים אלה כוללים מוטציות גנטיות של אובדן תפקוד בהומולוגים של גנים הגורמים ל- ALS או ביטוי מהונדס של גנים אנושיים של ALS. ישנם יתרונות רבים לדגמן ALS ב C. elegans. C. elegans הם חיה פשוטה ומתיחה עם מערכת עצבים מובחנת, פרדיגמות התנהגותיות מאופיינות היטב, והומולוגיה גנטית ניכרת לבני אדם6,7. קיימים כלים רבים לעבודה עם C. elegans, כולל יכולות עריכת גנום חזקות, בכתבים פלואורסצנטיים של ניוון עצבי, פרדיגמות סינון RNAi, גנטיקה מתיחה, ובדיקות התנהגותיות ופנוטיפיות מבוססות. ג. מודלים אלגנס של ALS recapitulate היבטים של מחלות אנושיות, כולל הצטברות של חלבון מסיס, ניוון עצבי, ומוות מוקדם8,9. יתר על כן, תפקוד מוטורי הכולל הפרעה של התנהגויות זחילה ושחייה קיים במודלים רבים של C. elegans ALS.
פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לאפיון פנוטיפים מוטוריים C. elegans : בחן הקטר הרדיאלי להערכת זחילה על משטח מוצק והערכת שחייה בנוזל (חבטות) באמצעות מעקב וניתוח אוטומטיים של WormLab. שיטות רגישות אלה לאפיון ליקויים מוטוריים מאפשרות השוואות של חומרה ומציעות כלים למדידת דיכוי ושיפורים של פנוטיפים מוטוריים. תנועת הקטר הרדיאלית מסמיכה הבדלים בתנועתיות זוחלת (תנועה סינוסורלית על משטח מוצק) בין אוכלוסיות של תולעים. בדיקה זו מנצלת את התנהגות המחקר הטבעית של C. elegans unstimulated על ידי הצבת תולעים במיקום אחד על צלחת וסימון מיקומם הסופי לאחר פרק זמן נתון10. לחלופין, שחייה בנוזל (חבטות) ספירת כיפופי גוף של תולעים בודדות לאורך פרק זמן מוגדר. הספירה הידנית של כיפופי הגוף על ידי העין האנושית היא עתירת זמן ובדרך כלל מציגה שונות ניכרת בין הנסיינים. השימוש במעקב וניתוח אוטומטיים בסיוע מחשב יכול לחסל חלק גדול מההשתנות הזו. בנוסף לאפיון של פגיעה מוטורית בסיסית של דגמי ALS, הן קטר רדיאלי והן בדיקות שחייה יכולות לזהות אפנון של פנוטיפים לוקומוטוריים מובחנים מהתערבויות גנטיות או קטנות של מולקולות. שיטות אלה יש תועלת ללימוד מודלים ALS וכל זן C. elegans המציג תנועתיות שונה.
Protocol
Representative Results
Discussion
קטר רדיאלי:
הרזולוציה של מעש זה נשלטת בקלות על ידי שינוי משתנה הזמן. הגדלת משך הזמן מקלה על התבוננות בהבדלים בין בעלי חיים עם פנוטיפים חמורים, ובכך מזהה הבדלים עדינים. עם זאת, מכיוון שניסיון זה מודד עקירה, אם זמן ההסתה הוארך זמן רב מדי, בעלי חיים עם תנועתיות נורמלית, כגון N2, ייסעו לשולי הצלחת, והתנהגות חיפוש מזון תוביל לנסיגה. זה יקטין באופן מלאכותי את מדידת המרחק שעבר. פרקי זמן ארוכים מדי עלולים לגרום להיעלמותם של הבדלים בין זנים, במיוחד בין בעלי חיים עם פנוטיפים מוטוריים פחות חמורים, כמו בעלי חיים להיות מפוזרים באופן שווה על פני הצלחת. קיצור משתנה הזמן ימנע מתולעים פעילות יותר למצוא את קצוות הלוח. שיטה זו אינה עוקבת אחר המרחק הכולל שעבר עבור כל תולעת, אלא דוחסת את המרחק שעבר עבור כל תולעת למרחק ליניארי ממרכז הצלחת. ככזה, הוא מטבעו פחות חזק מאשר שיטה המתעדת את אורך המסלול הכולל של תולעים בודדות. עם זאת, הבדיקה של הקטר הרדיאלי דורשת מעט מאוד הכשרת חוקרים, משתמשת בריאגנטים זולים יחסית הזמינים בדרך כלל ברוב מעבדות התולעים, והיא רגישה מספיק כדי לייצר תוצאות משמעותיות וניתן לשחזור. עבור מעבדות המעדיפות מעקב אוטומטי אחר וידאו, הוקמו בעבר מספר שיטות כדי לעקוב ולנתח תנועות סריקה12, או שניתן לשנות את פרמטרי התוכנה המשמשים לבדיקת השחייה במאמר זה כדי לאפשר זיהוי וניתוח סריקה.
ניסוי זה נעשה בדרך כלל בשכפולים עצמאיים משולשים, עם קבוצה של 30-40 תולעים לכל שכפול. כל שכפול מחולק לשתי לוחות שונים של 100 מ”מ או 150 מ”מ, עם 15-20 תולעים לצלחת. שימוש ביותר תולעים מהמומלץ לכל צלחת יכול להקשות על הניקוד ביעילות. מספר כולל של 90+ מופעל מספיק כדי לקבוע משמעות לפגיעה קלה, בינונית או חמורה בתנועתיות. להיות עקבי עם תזמון בין זנים ציון חיוני לדיוק רבייה. 30 דקות זה בדרך כלל מספיק זמן כדי ליצור הבדלים בין פנוטיפים בינוניים עד חמורים כמו זנים מהונדסים המבטאים מוטציה אנושית TDP-43 בהשוואה לתולעים מסוג בר (איור 4). אם משתנה הזמן יוארך, מומלץ גם להגדיל את גודל הצלחת מ 100 מ”מ ל 150 מ”מ. גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה ולחות יכולים להשפיע על בדיקת ישבן זו, אשר מתבצעת בדרך כלל בטמפרטורת החדר הסביבה, ולכן חשוב תמיד להשתמש בבקרה מסוג בר (N2) בעת השוואה בין שכפולים. בנוסף, זה בדיקות יכול למדוד את תנועתיות של כמה זנים שאינם מפגינים התנהגות שחייה נורמלית בנוזל (חבטות), מה שהופך אותו השלמה שימושית כדי assay השחייה.
שחייה:
השימוש במערכת ההדמיה והרכישה כדי להפוך את המעקב והניתוח של שחייה בתולעים לאוטומטיים מאפשר נתונים קפדניים ובלתי משוחדים. עם זאת, ישנם מספר גורמים במהלך ההתקנה הראשונית של הניסוי כי צריך להיות נשלט בין דגימות. אלה כוללים את הזמן להתאקלם לנוזל לפני תחילת ההקלטה, תנאי סביבה (כלומר, טמפרטורה, לחות), והגדרות אור והקלטה עקביות. בשלב ההקלטה, ישנן מספר תכונות המסייעות להפחית את השונות בין הצלחות. אלה כוללים מצלמה משולבת המותקנת על מסלול ושלב שדה בהיר שהופך את הקלטת הווידאו לעקבית בין לוחות, סיכוך סביב הבמה המונע השתקפויות, בוהק ותנועות אוויר בזמן ההקלטה, וחבילת תוכנה חזקה המזהה באופן אמין תולעים ומאפשרת תיקון ידני של רצועות בעיבוד וידאו. בפרוטוקול זה, קטעי וידאו של צלחת 35 מ”מ עם תולעים נרשמים במשך 1 דקה ולאחר מכן מעובד באמצעות חבילת התוכנה. לאחר העיבוד, תיקון ידני של רצועות מבטיח שהתנהגויות תולעת תירשם במדויק מבלי לבלבל שגיאות מעקב. נתוני ספירת הספירה והמעקב משמשים לקביעת תורות לדקה כהקראה סופית. כדי להבטיח רבייה, הנתונים נאספים על פני מינימום של 3 ניסויי שכפול עצמאיים, כל אחד עם 40-50 בעלי חיים ציון, כדי להשיג מספר סופי משולב של בעלי חיים 120-150. מספר זה מספיק כדי להפלות הבדלים קטנים בהתנהגות השחייה מתולעי בקרה. לחלק מהתולעים יש ליקויים מוטוריים חמורים מכדי להיתפס על ידי עשייה שוחה. לדוגמה, אם בעלי החיים ממוקמים בתלתל בינוני נוזלי במקום לבצע את התגובה החבטות הצפויה, תם זה לא לתעד תנועות אלה במדויק ובוחן תנועה אחר, כגון תנועה רדיאלית, עשוי ללכוד טוב יותר את פגמי תנועתיות אלה. הפרוטוקול שסופק משתמש במערכת הדמיה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים נוספים), אך מערכות מעקב אחר תולעים אחרות עשויות לספק כלי דומה, כאשר חלקן מקורות פתוחים12. שיטות שפורסמו בעבר מתארות ניקוד ידני של תולעת thrashing13. בעוד שהניתוח האוטומטי מייצר מספר מדדים עבור כל תולעת בודדת, זיהוי כיפופי גוף הנמדדים בתהכים לדקה, מספק תוצאות עקביות בין ניסויים ומעקבים היטב עם ניקוד קונבנציונלי של תולעים thrashes בעין.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לסוקרים על הערות והצעות מועילות. אנו מודים לאלין סקסטון, ברנדון הנדרסון וג’ייד סטיר על הסיוע הטכני יוצא הדופן. אנו מודים לבריאן קריימר ורבקה קו על הסיוע בפיתוח המעשים הללו. חומר זה הוא תוצאה של עבודה הנתמכת במשאבים ושימוש במתקנים במערכת הבריאות של VA Puget. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מארה”ב (ארה”ב) המחלקה לענייני יוצאי צבא (VA) מעבדה ביו-רפואית מחקר ופיתוח שירות [מענק סקירת הצטיינות #I01BX004044 N.F.L.]
Materials
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
| Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
| Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
| Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
| Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
| Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
| Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
| Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
| ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
| M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
| p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
| p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
| Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
| WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |
References
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).
- Arai, T., et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Mejzini, R., et al. ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now. Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).
- Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. ALS/FTLD: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).
- Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).
- Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).
- Robatzek, M., Thomas, J. H. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network. Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
- Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. . WormBook. , 1551 (2006).
