تقييم ضعف المحرك في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري
Summary
يصف هذا البروتوكول اثنين من المقايسات الحساسة للتمييز بين خفيفة, معتدلة, وضعف الحركة الشديدة في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري, مع فائدة عامة لسلالات C. elegans , مع تغيير الحركة.
Abstract
يتميز التصلب الجانبي الضموري العصبي (ALS) بفقدان تدريجي للخلايا العصبية الحركية مصحوبا بضعف العضلات وضعف الحركة الذي يزداد سوءا مع مرور الوقت. في حين تم إحراز تقدم كبير في تحديد الدوافع الوراثية لمرض القاعدة في لوس لمجموعة فرعية من المرضى ، فإن غالبية الحالات لديها مسببات غير معروفة. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء خلل الخلايا العصبية الحركية وانحطاط ليست مفهومة جيدا. ولذلك، هناك حاجة مستمرة إلى تطوير وتوصيف نماذج تمثيلية لدراسة هذه العمليات. يمكن للكينورفهابيتيز elegans تكييف حركتهم مع القيود المادية لمحيطهم ، مع اثنين من نماذج الحركة الأولية التي تمت دراستها في بيئة مختبرية – الزحف على سطح صلب والسباحة في السائل. هذه تمثل تفاعل معقد بين الإحساس والخلايا العصبية الحركية والعضلات. C. elegans نماذج ALS يمكن أن تظهر ضعف في واحد أو كل من هذه النماذج الحركة. يصف هذا البروتوكول اثنين من المقايسات الحساسة لتقييم الحركة في C. elegans: فحص الحركة الشعاعية الأمثل قياس الزحف على سطح صلب وطريقة آلية لتتبع وتحليل السباحة في السائل (سحق). بالإضافة إلى توصيف الضعف الحركي الأساسي لنماذج ALS ، يمكن لهذه المقايسات الكشف عن قمع أو تعزيز الأنماط الظاهرية من التدخلات الجينية أو الصغيرة. وهكذا، هذه الأساليب لها فائدة لدراسة نماذج ALS وأي سلالة C. elegans أن المعارض تغيير الحركة.
Introduction
التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو مرض عصبي موهن مرتبط بالشيخوخة له تأثير خاص على الخلايا العصبية الحركية. يتميز المرض بفقدان الخلايا العصبية الحركية في الدماغ والحبل الشوكي وضعف المحرك التدريجي. وهذا يؤدي إلى إعاقة وظيفية كبيرة والوفاة المبكرة، وعادة في غضون 3-5 سنوات بعد التشخيص1. الطفرات في ما لا يقل عن 38 الجينات يمكن أن يسبب ALS; ومع ذلك ، فإن معظم المرضى الذين يعانون من المرض تتراكم إدراجات في كل مكان من البروتين TDP – 43 وعلم الأمراض الأساسي في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية2،3،4. وقد تم تطوير عدد من النماذج الحيوانية لدراسة الآليات الكامنة التي تسبب أو تساهم في المرض في الجسم الحي (استعرضت in5).10 في C. elegans، وتشمل هذه النماذج الطفرات الوراثية فقدان وظيفة في homologs من الجينات المسببة للأمراض القاعدة أو التعبير المعدل وراثيا من الجينات ALS الإنسان. هناك العديد من المزايا لنمذجة ALS في C. elegans. C. elegans هي بسيط قابل للسحب مع نظام عصبي متميز ، ونماذج سلوكية متميزة ، وولوجيا هوولوجيا جينية كبيرة للبشر6،7. توجد العديد من الأدوات للعمل مع C. elegans ، بما في ذلك قدرات تحرير الجينوم القوية ، في المراسلين الفلوريين في الجسم الحي من التنكس العصبي ، ونماذج فحص RNAi ، وعلم الوراثة القابل للسحب ، والمقايسات السلوكية والفينوتينية الراسخة. C. elegans نماذج من ALS تلخيص جوانب من الأمراض البشرية, بما في ذلك تراكم البروتين غير قابل للذوبان, تنكس الأعصاب, والموت المبكر8,9. علاوة على ذلك ، فإن الخلل الحركي الذي يتميز باضطراب في كل من سلوكيات الزحف والسباحة موجود في العديد من طرازات C. elegans ALS.
يصف هذا البروتوكول طريقتين لتوصيف الأنماط الظاهرية الحركية C. elegans : المقايسة الحركية الشعاعية لتقييم الزحف على سطح صلب وتقييم السباحة في السائل (سحق) باستخدام تتبع وورملاب الآلي والتحليل. هذه الأساليب الحساسة لوصف العجز الحركي تسمح بمقارنات الشدة وتوفر أدوات لقياس القمع والتحسينات في الأنماط الظاهرية الحركية. يحدد اختبار الحركة الشعاعية الاختلافات في الحركة الزاحفة (الحركة الجيوب الأنفية على سطح صلب) بين مجموعات الديدان. يستفيد هذا المقايسة من سلوك الاستكشاف الطبيعي غير المحفز C. elegans عن طريق وضع الديدان في موقع واحد على طبق ووضع علامة على موقعها النهائي بعد فترة زمنية معينة10. بدلا من ذلك ، السباحة في السائل (سحق) المقايسات عد الانحناءات الجسم من الديدان الفردية على مدى فترة محددة من الزمن. العد اليدوي للانحناءات الجسم بالعين البشرية هو الوقت المكثف وعادة ما يظهر تباين كبير بين المجربين. ويمكن أن يؤدي استخدام التتبع والتحليل الآلي بمساعدة الحاسوب إلى القضاء على الكثير من هذا التباين. بالإضافة إلى توصيف الضعف الحركي الأساسي لنماذج ALS ، يمكن لكل من الحركة الشعاعية ومقاايسات السباحة الكشف عن تعديل الأنماط الظاهرية الحركية المتميزة من التدخلات الجينية أو الصغيرة للجزيء. هذه الأساليب لها فائدة لدراسة نماذج ALS وأي سلالة C. elegans التي تعرض الحركة المتغيرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحركة الشعاعية:
يتم التحكم بسهولة في دقة هذا المقايسة عن طريق تغيير متغير الوقت. زيادة طول الوقت يجعل من الأسهل لمراقبة الاختلافات بين الحيوانات مع الأنماط الظاهرية الشديدة، وبالتالي تحديد الاختلافات الدقيقة. ومع ذلك ، لأن هذا المقايسة يقيس الإزاحة ، إذا تم تمديد وقت الفحص لفترة طويلة جدا ، فإن الحيوانات ذات الحركة العادية ، مثل N2 ، ستسافر إلى حواف اللوحة ، وسيؤدي سلوك الأعلاف إلى التراجع. وهذا من شأنه أن يقلل بشكل مصطنع قياس المسافة المقطوعة. قد تؤدي الفترات الزمنية الطويلة جدا إلى اختفاء الاختلافات بين السلالات ، خاصة بين الحيوانات ذات الأنماط الظاهرية الحركية الأقل حدة ، حيث تصبح الحيوانات مشتتة بالتساوي عبر اللوحة. تقصير متغير الوقت سيمنع الديدان الأكثر نشاطا من العثور على حواف اللوحة. لا تتبع هذه الطريقة المسافة الإجمالية المقطوعة لكل دودة ولكنها تضغط المسافة المقطوعة لكل دودة إلى مسافة خطية من وسط اللوحة. على هذا النحو ، فهي بطبيعتها أقل قوة من الطريقة التي تسجل طول المسار الإجمالي للديدان الفردية. ومع ذلك، يتطلب فحص الحركة الشعاعية القليل جدا من تدريب الباحثين، ويستخدم الكواشف بأسعار معقولة نسبيا التي تتوفر عادة في معظم مختبرات الديدان، وحساسة بما يكفي لتحقيق نتائج كبيرة وقابلة للاستنساخ. بالنسبة للمختبرات التي تفضل تتبع الفيديو الآلي، تم إنشاء العديد من الطرق مسبقا لتتبع وتحليل حركات الزحف12، أو يمكن تغيير معلمات البرامج المستخدمة في فحص السباحة في هذه الورقة للسماح بالكشف عن الزحف وتحليله.
وعادة ما تتم هذه التجربة في تكرارات مستقلة ثلاثية، مع مجموعة من 30-40 دودة لكل تكرار. يتم تقسيم كل تكرار على اثنين من لوحات مختلفة 100 ملم أو 150 ملم، مع 15-20 الديدان لكل لوحة. استخدام الديدان أكثر من الموصى بها لكل لوحة يمكن أن تجعل من الصعب تسجيل كفاءة. عدد إجمالي سجل من 90 + هو مدعوم بما فيه الكفاية لتحديد أهمية خفيفة، معتدلة، أو شديدة ضعف الحركة. أن تكون متسقة مع التوقيت بين السلالات المسجلة أمر ضروري للدقة والتكرار. 30 دقيقة عموما طويلة بما يكفي لتحديد الاختلافات بين الأنماط الظاهرية المعتدلة إلى الشديدة مثل السلالات المعدلة وراثيا التعبير عن TDP-43 متحولة الإنسان مقارنة مع الديدان البرية من نوع (الشكل 4). إذا تم تمديد متغير الوقت، فمن المستحسن أيضا زيادة حجم اللوحة من 100 ملم إلى 150 ملم. يمكن أن تؤثر العوامل البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة على هذا المقايسة ، التي تتم عادة في درجة حرارة الغرفة المحيطة ، لذلك من المهم استخدام عنصر تحكم من النوع البري (N2) دائما عند المقارنة عبر التكرارات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا المقايسة قياس حركية بعض السلالات التي لا تظهر سلوك السباحة العادي في السائل (سحق)، مما يجعلها تكملة مفيدة لمقايسة السباحة.
فحص السباحة:
استخدام نظام التصوير والاستحواذ لأتمتة تتبع وتحليل السباحة دودة يسمح لبيانات صارمة وغير متحيزة. ومع ذلك، هناك عدة عوامل أثناء الإعداد الأولي للتجربة التي تحتاج إلى التحكم بين العينات. وتشمل هذه الوقت للتأقلم مع السائل قبل بدء التسجيل، والظروف المحيطة (أي درجة الحرارة والرطوبة)، وإعدادات الإضاءة والتسجيل المتسقة. على مرحلة التسجيل، هناك العديد من الميزات التي تساعد على تقليل التباين بين اللوحات. وتشمل هذه الكاميرا المتكاملة التي شنت على المسار ومرحلة مشرق الميدان الذي يجعل تسجيل الفيديو متسقة بين لوحات، والتدريع حول المرحلة التي تمنع الانعكاسات، ووهج، وحركات الهواء أثناء التسجيل، وحزمة برامج قوية أن يكشف موثوق الديدان ويسمح لتصحيح يدوي للمسارات في مرحلة ما بعد المعالجة الفيديو. في هذا البروتوكول، يتم تسجيل مقاطع فيديو للوحة 35 مم مع الديدان لمدة دقيقة واحدة ثم معالجتها باستخدام حزمة البرامج. بعد المعالجة، يضمن التصحيح اليدوي للمسارات تسجيل سلوكيات الفيروس المتنقل بدقة دون الخلط بين أخطاء التتبع. يتم استخدام بيانات العد وتتبع المدة لتحديد المنعطفات في الدقيقة كمقروءة نهائية. ولضمان إمكانية إعادة الإنتاج، يتم جمع البيانات على مدى ما لا يقل عن 3 تجارب تكرار مستقلة، سجل كل منها 40-50 حيوانا، لتحقيق العدد النهائي المشترك للحيوانات 120-150. هذا العدد يكفي للتمييز بين الاختلافات الصغيرة في سلوك السباحة من الديدان السيطرة. بعض الديدان لديها عجز في المحركات شديدة جدا بحيث لا يمكن التقاطها من قبل المقايسات السباحة. على سبيل المثال، إذا وضعت الحيوانات في حليقة متوسطة سائلة بدلا من تنفيذ الاستجابة المتوقعة للسحق، فإن هذا الفحص لن يسجل تلك الحركات بدقة، وقد يلتقط فحص حركة آخر، مثل الحركة الشعاعية، تلك العيوب الحركية بشكل أفضل. يستخدم البروتوكول المقدم نظام تصوير متاح تجاريا (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل)، ولكن قد توفر أنظمة تتبع الديدان الأخرى أداة مماثلة، وبعضها مفتوح المصدر12. تصف الأساليب المنشورة سابقا التسجيل اليدوي لدودة thrashing13. في حين أن التحليل الآلي ينتج عددا من المقاييس لكل دودة على حدة ، والكشف عن الانحناءات الجسم الذي يقاس في thrashes في الدقيقة الواحدة ، ويوفر نتائج متسقة بين التجارب والمسارات بشكل جيد مع التهديف التقليدية من الديدان thrashes بالعين.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المراجعين على التعليقات والاقتراحات المفيدة. نشكر ألين ساكستون وبراندون هندرسون وجايد ستير على المساعدة التقنية المتميزة. نشكر براين كرايمر وريبيكا كو على المساعدة في تطوير هذه المقايسات. هذه المواد هي نتيجة للعمل المدعوم بالموارد واستخدام المرافق في نظام الرعاية الصحية VA Puget Sound. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) وزارة شؤون المحاربين القدامى (VA) خدمة البحوث والتطوير في المختبرات الطبية الحيوية [منحة مراجعة الجدارة #I01BX004044 إلى N.F.L.]
Materials
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | – | Aquire your strains as desired, N2 is a useful control strain |
| Disposable pasteur pipets, borosilicate glass | VWR | 14673-010 | Glass pipet used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Disposable petri dishes, 35x10mm | VWR | 10799-192 | Assay plates for WormLab Imaging System |
| Disposable petri dishes, 60x15mm | VWR | 25384-090 | Stock plates for worms |
| Disposable petri dishes, 100x15mm | VWR | 25384-302 | Standard radial locomotion assay plate |
| Disposable petri dishes, 150x15mm | VWR | 25384-326 | Longer time frame radial locomotion assay plate |
| Dissecting microscope | Leica | M80 | Scope for maintaining worms and setting up radial locomotion assays |
| Fine-tipped markers | VWR | 52877-810 | Need at least 2 colors for radial locomotion assays. Fine tips required for accuracy. |
| Flatbed Scanner | Amazon | Epson Perfection V850 | Optional for radial locomotion assay. Protocol assumes a resolution of 300dpi, most scanners would work fine |
| ImageJ | NIH | – | Optional free software provided by the NIH – https://imagej.nih.gov/ij/ |
| M9 buffer | VWR | IC113037012 | Medium used for swimming assay. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| NGM (Nematode Growth Medium) | VWR | 76347-412 | Medium used to cultivate C. elegans. Can be made from scratch, see WormBook: Maintenance of C. elegans |
| OP50 bacteria | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Primary food source for C. elegans |
| p1000 pipettor | VWR | 76207-552 | Pipettor, used in swimming assay |
| p1000 tips | VWR | 83007-384 | Tips for pipettor, used in swimming assay |
| Platinum wire, 0.2032mm diameter | VWR | BT136585-5M | Fine gauge platinum wire used to create worm pick – hold glass pipette in one hand and ~1" of platinum wire (held by pliers) in the other over a flame to join. |
| Ruler | VWR | 56510-001 | Need to score radial locomotion assays |
| WormLab Imaging System | MBF Bioscience | WormLab | The Imaging System includes WormLab hardware (bright field stage, camera, and housing) and WormLab software. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system |
References
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3 (2009).
- Arai, T., et al. TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Mejzini, R., et al. ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now. Frontiers in Neuroscience. 13, 1310 (2019).
- Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. ALS/FTLD: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).
- Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).
- Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).
- Robatzek, M., Thomas, J. H. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network. Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
- Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M., Hart, A. C. . WormBook. , 1551 (2006).
