הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה
Summary
בדרוסופילה, גרעין הביצית עובר הגירה תלוית מיקרוטובולה במהלך oogenesis. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפותח כדי לעקוב אחר הנדידה על ידי ביצוע הדמיה חיה על תאי ביצה ex-vivo. ההליך שלנו שומר על תאי ביצים בחיים במשך 12 שעות כדי לרכוש סרטים תלת-ממדיים רב-תכליתיים לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.
Abstract
הדמיית תאים חיים נחוצה במיוחד כדי להבין את המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את תנועות האברונים, סידורים מחדש של ציטוסקלטון או דפוסי קוטביות בתוך התאים. בעת לימוד מיקום גרעין oocyte, טכניקות הדמיה חיה חיוניות כדי ללכוד את האירועים הדינמיים של תהליך זה. תא הביצים Drosophila הוא מבנה רב תאי ומערכת מודל מעולה ללמוד תופעה זו בשל גודלה הגדול וזמינות של כלים גנטיים רבים. במהלך Drosophila באמצע oogenesis, הגרעין נודד מעמדה מרכזית בתוך oocyte לאמץ עמדה אסימטרית בתיווך כוחות שנוצרו microtubule. נדידה זו ומיצוב הגרעין נחוצים כדי לקבוע את צירי הקוטביות של העובר ואת הזבוב הבוגר הבא. מאפיין אחד של הגירה זו הוא שהיא מתרחשת בשלושה ממדים (3D), יצירת צורך בהדמיה חיה. לכן, כדי לחקור את המנגנונים המסדירים הגירה גרעינית, פיתחנו פרוטוקול כדי לתרבות את תאי הביצים נותחו ולבצע הדמיה חיה במשך 12 שעות על ידי רכישות בזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. בסך הכל, התנאים שלנו מאפשרים לנו לשמר את תאי הביצים של Drosophila בחיים במשך תקופה ארוכה של זמן, ובכך לאפשר את השלמת ההגירה הגרעינית להיות לדמיין במספר רב של דגימות בתלת-ממד.
Introduction
במשך מספר שנים, ביצינה Drosophila התפתח כמערכת מודל לחקר הגירה גרעינית. הביצית הדרוזופילה מתפתחת במבנה רב תאי הנקרא תא הביצים. תאי הביצה מקיפים 16 תאי נבט (15 תאי אחות וביציות) מוקפים בשכבה אפיתל של תאים סומטיים זקיקים. פיתוח תאי הביצים מחולק ל-14 שלבים (איור 1A),שבמהלכם הביצית תגדל ותצבר עתודות הדרושות להתפתחות מוקדמת של העובר. במהלך ההתפתחות, עם ארגון מחדש של מיקרוטובולות והובלה אסימטרית של דטרמיננטים אימהיים, הביציות מקוטבות לאורך הצירים האנטרו-דורסלים והדורסו-גחון. צירים אלה קובעים את צירי הקוטביות הבאים של העובר ואת המבוגר הנובע מהפריה של הביצית1. במהלך אוגנזה, הגרעין מאמץ עמדה אסימטרית בביציות. בשלב 6, הגרעין מרוכז בתא. לאחר אות שטרם זוהה הנפלט מתאי הזקיקים האחוריים המתקבל על ידי הביציות, הגרעין נודד לכיוון הצומת בין קרום הפלזמה הקדמי והלבטי בשלב 7 (איור 1B)2,3. עמדה אסימטרית זו נדרשת כדי לגרום לקביעת ציר דורסו-גחון.
איור 1: תאי הביצים של Drosophila melanogaster. (A)ביציות קבועות מזבובים מהונדסים המבטאים Fs(2)Ket-GFP המתייגת את המעטפות הגרעיניות ואת ubi-PH-RFP המתייג את קרום הפלזמה. השחלות מורכבות ממפתחת תאי ביצים בשלבים שונים. ההתבגרות גדלה לאורך הציר האחורי-הקדמי עם הנבט בקצה הקדמי (משמאל) שבו שוכן תא הגזע של החיידק והשלב הישן בקצה האחורי (מימין). (B)Z-הקרנה של תא ביצה חיה על ידי ספינינג דיסק קונפוקלי מיקרוסקופיה בשלב 6 של oogenesis (משמאל), שבו הגרעין מרוכז בביצית. הגרעין יעבור לאמץ תנוחה א-סימטרית בשלב 7 (מימין) במגע עם קרום הפלזמה הימני (בין הביציות לתא האחות) וקרום הפלזמה לרוחב (בין הביציות לתאי הזקיקים). עמדה זו תעורר את קביעת הצד הדו-צדדי, וכך גם את הציר הגחון-דורסו של תא הביצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
במשך עשורים רבים, הגירה גרעינית זו נחקרה על רקמות קבועות על ידי חיסון. גישה זו אפשרה במיוחד להוכיח כי תהליך זה תלוי ברשת צפופה של microtubules4,5. לאחרונה, פיתחנו פרוטוקול המציע תנאים התואמים הדמיה חיה של oocyte במהלך מספר שעות, מה שמאפשר ללמוד את התהליך הזה באופן דינמי6.
לפיכך, בפעם הראשונה, הצלחנו לתאר כי הגרעין יש מסלולים מועדפים ומאופיינים במהלך נדידתו, אחד לאורך קרום הפלזמה הנעים (APM) והשני לאורך קרום הפלזמה לרוחב (LPM) של oocyte (איור 2). תוצאות עדכניות אלה מדגישות את החשיבות של פרוטוקולי הדמיה חיה בעת לימוד תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית.
איור 2: ייצוג סכמטי של נתיבי ההעברה השונים של הגרעין. בשלב 6 של oogenesis, ביוציט הוא תא גדול עם גרעין מרכזי. בשלב זה, ציר הקוטביות הקדמית-אחורית מוגדר עם קרום פלזמה אחורי / לרוחב של הביצית במגע עם תאי הזקיקים וקרום הפלזמה הקדמי (בצהוב) נמצא במגע עם תאי האחות2. דיווחנו בעבר כי הגרעין יכול לנדוד לאורך קרום הפלזמה הקדמי (APM), לאורך קרום הפלזמה לרוחב (LPM), או דרך הציטופלסמה (STAD, היישר לקליפת המוח הקדמית-דורסל)6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
נדידת גרעין הביצית היא תופעה של כ 3 שעות6, ועד כה, האירוע המפעיל את תחילת ההגירה בפועל אינו ידוע. תחילת הנדידה יכולה להתעכב גם על ידי מוטציות חלבון המשמשות לחקר מנגנון זה. משתנים לא ידועים אלה הניעו אותנו לרכוש תמונות על פני תקופות זמן ארוכות (10-12 שעות). לכן חשוב לוודא שהאוציטים יישארו בחיים. ככל שחדר הביצים מתפתח, הוא מתרבה לאורך הציר האנטרו-אחורי מצורה כדורית לצורה אליפטית. התארכות זו מונעת על ידי סיבוב של תאים זקיקים, המתרחש משלב 1 לשלב 8, בניצב לציר האנטרו-אחורי7. בנוסף, נדן צינורי של שריר עם רכוש פועם מקיף את תאי הביצים. תפקידו הפיזיולוגי הוא לדחוף את הזקיקים המתפתחים לכיוון oviduct ברציפות8. כדי להגביל את התנועות הגורמות לתנודות של תאי הביצים לאחר ניתוחם, עיצבנו מיקרו-תא תצפית בגובה 150 מיקרומטר(איור 3A). גובה זה גבוה באופן שולי מגודלו של זקיק בשלבים 10 ו -11. זה מגביל במידה ניכרת את התנועות האנכיות של המדגם תוך שמירה על הסיבוב של תא הביצה, ובכך וכתוצאה מכך פגמים מוגבלים בהתפתחות הזקיק. לאחר מכן אנו מבצעים הדמיה חיה במשך 12 שעות על תאי ביצים ניתחו על ידי רכישות זמן-לשגות מרובות מיקום באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לחקר ההגירה הגרעינית של ביצית בין שלבים 6 עד 7.
איור 3: ייצוג סכמטי של תא התצפית. (A) (תצוגה עליונה) ממדים מדויקים של שקופית האלומיניום עם הגבהים (A’) וההיקפים (A’) של הבאר שנקדחה באמצע השקופית. (B)(תצוגה תחתונה) כיסוי החוסם את הבאר אטום לשקופית עם שומן סיליקון. (C)(מבט עליון) השחלות נותחו מתפתחות במדיום הדמיה המכוסה על ידי קרום חדיר לגז. שמן Halocarbon משמש לייצוב הממברנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
על מנת לעקוב אחר הנדידה הגרעינית ולהעריך במדויק את המסלולים בביציות, יש צורך בסמנים הן לעוטף הגרעיני והן לממברנת הפלזמה. במטרה זו נבחרו שני טרנסג’נים בעלי יחס אות/רעש גבוה ואינם דוהים במהלך ההדמיה החיה. כדי לתייג את קרום הפלזמה, מומלץ להשתמש P[ubi-PH-RFP] המקודד את תחום ההומולוגיה של פלקסטרין (PH) של הפוספוליפאז האנושי C ∂1 (PLC∂1) התמזג ל- RFP. דומיין PH זה נקשר ל- PI phosphoinositide(4,5)P2 המופץ לאורך קרום הפלזמה של הביציות9. עבור המעטפה הגרעינית, P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP זן מלכודת חלבון שבו GFP מוכנס בתוך הגן קידוד Drosophila ß-importin מציג הומוגני אות אינטנסיבי10. זבובים צעירים (בני 1-2 ימים) ממוקמים בבקבוקונים טריים המכילים שמרים יבשים 24-48 שעות לפני ניתוח השחלות.
עבור זה הדמיה חיה assay, חתיכה בעובי 1 מ”מ של אלומיניום, אשר אינו פעיל עבור המדגם, נחתך לתוך הממדים של שקופית מיקרוסקופיה. יש לו חור בקוטר 16 מ”מ במרכז השקופית כי כבר counterbored ל 0.85 מ”מ. ל-counterbore זה יש חור נוסף בקוטר 6 מ”מ עם עומק של 150 מיקרומטר(איור 3A). כיסוי מודבק עם שומן סיליקון (אינרטי לדגימה) בתחתית תא האלומיניום(איור 3B). לאחר הנחת הדגימות בבאר הבינונית, קרום חדיר לחילופי O2/CO2 ממוקם מעל המדיום ומוקף בשמן הילוקרבון(איור 3C).
עבור הניתוח, מומלץ להשתמש במלקחיים מפלדת אל-חלד עם ממד קצה של 0.05 x 0.02 מ”מ, ומחטים בקוטר 0.20 מ”מ להפרדת השחלות(איור 4B,C). הגרעינים הנודדים מצולמים על מיקרוסקופ הפוך של דיסק מסתובב CSU-X1 המצויד במצלמה. תמונות מרובות מיקום נרכשו על ידי זמן לשגות כל 15 דקות ב 24 °C (50 °F). מרווח של 15 דקות מאפשר ביצוע רכישות מרובות עמדות עם צילומים מוגבלים של חלבוני הפלואורסצנט והפוטו-טוקסיקיות עבור הדגימות. יתר על כן, מרווח זמן קצר יותר לא יספק נתונים אינפורמטיביים הרבה יותר כדי לעקוב אחר המסלולים הגרעיניים. הסרטים מעובדים ומנותחים באמצעות תוכנת פיג’י11.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקולים אחרים מתארים כיצד להכין ולתרבות תאי הביצה Drosophila ex vivo לבדיקת הדמיה חיה12,13. החידוש של פרוטוקול זה הוא השימוש בתא הדמיה שנבנה באמצעות מגלשת אלומיניום חלולה, כיסוי, וקרום חדיר O2/ CO2. היתרון העיקרי של מערך זה הוא להגביל את התנועה ב- Z מבל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מאוד לז’אן אנטואן לפסאנט וניקולס טיסוט שפיתחו את הפרוטוקול במקור ושיתפו איתנו כמה אלמנטים גרפיים של איור 3. אנו מודים לפאני רולנד-גוסלין שצילמה את התמונות של איור 4. אנו מודים גם לחברי מעבדה אחרים על דיונים מועילים שתרמו להחמצת טכניקה זו ונתנאל הנמן על הערותיו שעזרו לשפר את כתב היד הזה. אנו מכירים במתקן הליבה של ImagoSeine של המכון ז’אק מונוד, חבר בצרפת-BioImaging (ANR-10-INBS-04). מאליס לו נתמך על ידי מלגת דוקטורט ממשרד המחקר הצרפתי (MESRI). אנטואן Guichet ופרד ברנרד נתמכו על ידי ARC (גרנט PJA20181208148), האגודה des Entreprises contre le Cancer (גרנט Gefluc 2020 #221366) ועל ידי מענק הופעתה מאוניברסיטת IdEx דה פריז (ANR-18-IDEX-0001).
Materials
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24×50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 – 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 – 188 | Observation-chamber preparation |
References
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A. Symmetry breaking during drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).
- Bernard, F., Lepesant, J. -. A., Guichet, A. Nucleus positioning within Drosophila egg chamber. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).
- Januschke, J., et al. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133, 129-139 (2006).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Cetera, M., Horne-Badovinac, S. Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).
- Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte. Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).
- Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ‘ n Villa. Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).
- Chanet, S., Huynh, J. R. Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells. Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).
- Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis. Science. 336 (6084), 999-1003 (2012).
- Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).
