Büyüme, Arınma ve Onkolitik Herpes Simpleks Virüs Titrasyon
Summary
Bu yazıda, klinik öncesi kullanım için onkolitik herpes simpleks virüsünün basit bir büyüme, arınma ve titrasyon yöntemini açıklıyoruz.
Abstract
Onkolitik herpes simpleks virüsü (oHSV) gibi onkolitik virüsler (OV’ler), kanser immünoterapisi alanında hızla büyüyen bir tedavi stratejisidir. OHSV de dahil olmak üzere OV’ler, anti-tümör bağışıklığını teşvik ederken kanser hücrelerini (sağlıklı / normal hücreleri koruma) seçici olarak çoğaltır ve öldürür. Bu benzersiz özellikler nedeniyle, oHSV tabanlı tedavi stratejileri, FDA onaylı talimogene laherparevec (T-Vec) dahil olmak üzere, preklinik ve klinik olarak kanserin tedavisi için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Büyüme, arınma ve titrasyon, deneysel çalışmalar için kullanılmadan önce oHSV’ler de dahil olmak üzere herhangi bir TV için üç temel laboratuvar tekniğidir. Bu makalede, Vero hücrelerinde oHSV’yi yükseltmek için basit bir adım adım yöntem açıklanmaktadır. İhSV’ler çoğaldıkça Vero hücrelerinde sitopatik etki (CPE) üretirler. Enfekte hücrelerin% 90-100’ü cpe gösterdiğinde, hafifçe hasat edilir, benzonaz ve magnezyum klorür (MgCl2)ile muamele edilir ve sakkaroz-gradyan yöntemi kullanılarak saflaştırmaya tabi tutulur. Saflaştırmadan sonra, enfeksiyöz oHSV sayısı (plak oluşturan birimler veya PTU’lar olarak belirlenir) Vero hücrelerinde bir “plak tahlil” ile belirlenir. Burada açıklanan protokol, hücre kültüründe ve in vivo hayvan deneylerinde in vitro çalışmalar için yüksek titer oHSV stoğu hazırlamak için kullanılabilir.
Introduction
Onkolitik virüsler (OV’ler) kanser immünoterapisinin ortaya çıkan ve benzersiz bir şeklidir. OV’ler seçici olarak tümör hücrelerinin içinde çoğalır ve lyse (normal / sağlıklı hücrelerin idaresi)1 anti-tümör bağışıklığını teşvik ederken2. Onkolitik herpes simpleks virüsü (oHSV), tüm OV’ler arasında en kapsamlı çalışılan virüslerden biridir. Klinikte en uzaktır, Talimogene laherparepvec (T-VEC) ileri melanom tedavisi için ABD’de FDA onayı alan ilk ve tekOV 3. T-VEC’ye ek olarak, genetik olarak tasarlanmış diğer birçok oHSV, farklı kanser türleri 3 , 4 , 5,6,7,8’depreklinik ve klinik olarak test edilmektedir. Mevcut gelişmiş rekombinant DNA biyoteknolojisi, terapötik transgene(ler)3,5için mühendislik yeni oHSV kodlamasının fizibilitesini daha da artırmıştır. Herhangi bir (yeni geliştirilen) oHSV in vitro ve in vivo çalışmalar için test edilemeden önce verimli bir oHSV yayılım, saflaştırma ve titer belirleme sistemi kritik öneme sahiptir. Bu makalede, oHSV büyümesinin (Vero hücrelerinde), saflaştırmanın (sakkaroz-gradyan yöntemiyle) ve titrasyonun (Vero hücrelerinde oHSV plak tahlili ile) basit bir adım adım yöntemi açıklanmaktadır (Şekil 1). Preklinik çalışmalar için yüksek kaliteli bir viral stok elde etmek için herhangi bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) laboratuvar ortamında kolayca benimsenebilir.
Vero, Bir Afrika yeşil maymun böbrek hücre hattı, oHSV yayılma 9 için en sık kullanılan hücre hattıdır9,10,11,12,13 Vero hücreleri kusurlu bir antiviral interferon sinyal yolu vardır14. Interferon genlerinin inaktive stimülatörü (STING) sinyali veren diğer hücre hatları da oHSV büyümesi için kullanılabilir12,13. Bu protokol, oHSV büyümesi ve plak tahlilleri için Vero hücrelerini kullanır. Yayılmadan sonra, oHSV ile enfekte hücreler toplanır, yutulur ve saflaştırmaya tabi tutulur, burada lislenmiş hücreler ilk olarak konak hücre DNA’sını bozmak, nükleik asit-protein toplamasını önlemek ve hücre lisatının viskozitesini azaltmak için benzonaz çekirdeği ile tedavi edilir. Benzonazın uygun aktivasyonu genellikle Mg2 +gerektirdiğinden, bu protokolde 1-2 mM MgCl2 kullanılır15. Benzonazla işlenmiş hücre lisatından konak hücre kalıntıları, yüksek hızlı sakkaroz-gradyan santrifüjlemeden önce seri filtrasyon ile daha da ortadan kalkar. Viskoz% 25 sakkaroz çözelti yastığı, sakkaroz tabakasından daha yavaş bir virüs geçiş hızı sağlamaya yardımcı olur, konak hücre ile ilgili bileşenleri süpernatanta bırakır, böylece saflaştırmayı iyileştirir ve peletteki virüs kaybını sınırlar16. Saflaştırılmış oHSV daha sonra Vero hücreleri üzerinde titratlanır ve viral plaklar Giemsa boyama17 veya X-gal boyama (LacZ kodlama oHSV’leri için)18ile görselleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol, düşük geçişli Vero hücrelerinde oHSV’nin büyümesiyle başlar. Vero hücre monolayerinin izdiahı, aşırı büyümüş hücreler Vero hücrelerine oHSV girişini azaltabilecek sıkı lifli yapılar geliştirebileceğinden virüs aşısı sırasında ~% 80 olmalıdır 20. % 90-100 CPE gözlendikten sonra, kültür süpernatantı çıkarılır, hücreler toplanır, VB / supernatant’ta yeniden depolanır (bkz. adım 1.4.6), snap-frozen ve daha sonra saflaştırma için -80 ° C’de s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Saha laboratuvarındaki araştırmalar kısmen DOD (W81XWH-20-1-0702) ve Dodge Jones Foundation-Abilene’den gelen fonlar tarafından desteklendi. Samuel D. Rabkin ve Melissa R.M. Humphrey nih (R01 CA160762) tarafından kısmen desteklendi.
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
