Рост, очистка и титрование онколитического вируса простого герпеса
Summary
В этой рукописи мы описываем простой метод роста, очистки и титрования онколитического вируса простого герпеса для доклинического использования.
Abstract
Онколитические вирусы (ОВ), такие как онколитический вирус простого герпеса (oHSV), являются быстро растущей стратегией лечения в области иммунотерапии рака. ОВ, включая oHSV, избирательно реплицируются и убивают раковые клетки (щадя здоровые / нормальные клетки), одновременно индуцируя противоопухолевый иммунитет. Из-за этих уникальных свойств стратегии лечения на основе oHSV все чаще используются для лечения рака, доклинически и клинически, включая одобренный FDA талимоген лагерпаревек (T-Vec). Рост, очистка и титрование являются тремя основными лабораторными методами для любых ОВ, включая oHSV, прежде чем их можно будет использовать для экспериментальных исследований. В этой статье описывается простой пошаговый метод усиления oHSV в клетках Vero. Когда oHSV размножаются, они производят цитопатический эффект (CPE) в клетках Vero. Как только 90-100% инфицированных клеток показывают CPE, их аккуратно собирают, обрабатывают бензоназой и хлоридом магния (MgCl2),фильтруют и подвергают очистке с использованием метода сахарозы-градиента. После очистки количество инфекционных oHSV (обозначенных как бляшеобразующие единицы или PФУ) определяется с помощью «анализа бляшек» в клетках Vero. Протокол, описанный в настоящем описании, может быть использован для получения высокотитерного запаса oHSV для исследований in vitro в клеточной культуре и экспериментов in vivo на животных.
Introduction
Онколитические вирусы (ОВ) являются новой и уникальной формой иммунотерапии рака. ОВ избирательно реплицируются и лизируют опухолевые клетки (щадя нормальные/здоровые клетки)1, индуцируя противоопухоляющий иммунитет2. Онколитический вирус простого герпеса (oHSV) является одним из наиболее широко изученных вирусов среди всех ОВ. Он находится дальше всего в клинике, причем Talimogene laherparepvec (T-VEC) является первым и единственным OV, получившим одобрение FDA в США для лечения прогрессирующей меланомы3. В дополнение к T-VEC, многие другие генетически модифицированные oHSV тестируются доклинически и клинически при различных типах рака3,4,5,6,7,8. Современная передовая рекомбинантная биотехнология ДНК еще больше повысила возможность разработки новых oHSV-кодирования для терапевтических трансгенов3,5. Эффективная система распространения, очистки и определения титра oHSV имеет решающее значение до того, как любой (недавно разработанный) oHSV может быть протестирован для исследований in vitro и in vivo. В данной работе описывается простой пошаговый метод роста oHSV (в клетках Vero), очистки (методом сахарозы-градиента) и титрования (путем анализа oHSV-бляшек в клетках Vero)(рисунок 1). Он может быть легко принят в любых лабораторных условиях уровня биобезопасности 2 (BSL2) для достижения высококачественного вирусного запаса для доклинических исследований.
Vero, африканская зеленая обезьянья клеточная линия почек, является наиболее часто используемой клеточной линией для распространения oHSV9,10,11,12,13, поскольку клетки Vero имеют дефектный противовирусный интерфероновый сигнальныйпуть 14. Другие клеточные линии с инактивированным стимулятором передачи сигналов генов интерферона (STING) также могут быть использованы для роста oHSV12,13. Этот протокол использует клетки Vero для роста oHSV и анализа бляшек. После размножения oHSV-инфицированные клетки собирают, литизируют и подвергают очистке, при этом лизированные клетки сначала обрабатывают нуклеазой бензоназы для деградации ДНК клеток-хозяев, предотвращения агрегации нуклеиновых кислот-белков и снижения вязкости клеточного лизата. Поскольку правильная активация бензоназы часто требуетMg 2+,1-2 мМ MgCl2 используется в этомпротоколе 15. Обломки клеток-хозяев из обработанного бензоназой клеточного лизата дополнительно удаляются путем последовательной фильтрации перед высокоскоростным центрифугированием градиента сахарозы. Вязкая подушка из 25% раствора сахарозы помогает обеспечить более медленную скорость миграции вируса через слой сахарозы, оставляя компоненты, связанные с клетками-хозяевами, в супернатанте, тем самым улучшая очистку и ограничивая потерю вируса в грануле16. Очищенный oHSV затем титруется на клетках Vero, а вирусные бляшки визуализируются окрашиванием Giemsa17 или окрашиванием X-gal (для LacZ, кодирующей oHSV)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол начинается с роста oHSV в низкопролетных клетках Vero. Слияние монослоя клеток Vero должно составлять ~ 80% во время инокуляции вируса, так как разросшиеся клетки могут развивать плотные волокнистые структуры, которые могут уменьшить проникновение oHSV в клетки Vero20. После ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории Saha частично поддерживались средствами DoD (W81XWH-20-1-0702) и Dodge Jones Foundation-Abilene. Сэмюэл Д. Рабкин и Мелисса Р.M. Хамфри были частично поддержаны NIH (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
