オンコ分解性ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖、精製、滴定

腫瘍分解ウイルス(OV)は、がん免疫療法の新しいユニークな形態です。OVは、抗^{腫瘍免疫を}誘導しながら腫瘍細胞(正常/健康細胞を温かく温かみ⁾¹に選択的に複製およびライゼする。単純ヘルペスウイルス(oHSV)は、すべてのOVの中で最も広範に研究されたウイルスの一つです。それは、タリモジーン・ラヘルパレプベック(T-VEC)が進行黒色腫³の治療のために米国でFDAの承認を受けた最初で唯一のOVである、診療所で最も遠いです。T-VECに加えて、他の多くの遺伝子組み換えoHSVは、異なる癌タイプ^{3、4、5、6、7、8}で前臨床的および臨床的にテストされている。現在の高度な組換えDNAバイオテクノロジーは、治療トランスジーン^3、5にコードする新しいoHSVをエンジニアリングする可能性をさらに高めています。oHSVの伝播、精製、およびタイターの決定の効率的なシステムは、(新しく開発された)oHSVをインビトロおよびインビボ研究のためにテストする前に重要である。本論文ではoHSV成長(ベロ細胞)、精製(ショ糖勾配法による)、および滴定(Vero細胞におけるoHSVプラークアッセイによる)の簡単なステップバイステップの方法について説明する(図1)。これは、任意のバイオセーフティレベル2(BSL2)実験室の設定で簡単に前臨床試験のための高品質のウイルスストックを達成するために採用することができます。

ベロは、アフリカの緑色のサルの腎臓細胞株であり、vero細胞が欠陥のある抗ウイルスインターフェロンシグナル伝達経路¹⁴を有するoHSV伝播^{9、10、11、12、13}に最も一般的に使用される細胞株である。インターフェロン遺伝子の不活性化刺激因子(STING)シグナル伝達を有する他の細胞株も、oHSV増殖^12,13に使用することができる。このプロトコルは、oHSV増殖およびプラークアッセイのためにベロ細胞を利用する。伝播後、oHSV感染細胞は、採取、分解、精製を行い、そこで、細胞をまずベンゾナーゼヌクレアーゼで処理して宿主細胞DNAを分解し、核酸タンパク質凝集を防止し、細胞ライセートの粘度を低下させる。ベンゾナーゼの適切な活性化は、多くの場合、Mg²⁺を必要とするため、1-2 mM MgCl₂がこのプロトコル¹⁵で使用されます。ベンゾナーゼ処理細胞リセートからの宿主細胞の破片は、高速スクロース勾配遠心分離の前に連続濾過によってさらに除去される。粘性25%のスクロース溶液クッションは、スクロース層を介したウイルス移動の速度を遅くし、宿主細胞関連成分を上清に残し、ペレット¹⁶の浄化およびウイルス損失の制限を改善するのに役立つ。精製されたoHSVは、次いでベロ細胞上で滴定され、そしてウイルスプラークは、17またはX-gal染色(LacZコードoHSV用⁾¹⁸のギムサ染色によって視覚化される。