צמיחה, טיהור, ו Titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי
Summary
בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה פשוטה של צמיחה, טיהור, ו titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי לשימוש פרה-קוליני.
Abstract
וירוסים אונקוליטיים (OVs), כגון וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי (oHSV), הם אסטרטגיית טיפול הגדלה במהירות בתחום האימונותרפיה של סרטן. OVs, כולל oHSV, לשכפל באופן סלקטיבי ולהרוג תאים סרטניים (חוסך תאים בריאים / נורמליים) תוך גרימת חסינות נגד גידולים. בשל תכונות ייחודיות אלה, אסטרטגיות טיפול מבוססות oHSV נמצאות בשימוש הולך וגובר לטיפול בסרטן, פרה-קלינית וקלינית, כולל talimogene laherparevec (T-Vec) שאושר על ידי ה-FDA. צמיחה, טיהור, טיטרציה הן שלוש טכניקות מעבדה חיוניות עבור כל OVs, כולל oHSVs, לפני שהם יכולים להיות מנוצלים למחקרים ניסיוניים. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה שלב אחר שלב להגברת oHSV בתאי Vero. כמו oHSVs להכפיל, הם מייצרים אפקט ציטופתי (CPE) בתאי Vero. פעם 90-100% מהתאים הנגועים מראים CPE, הם נקצרים בעדינות, מטופלים עם בנזיונז ומגנזיום כלורי (MgCl2), מסוננים, ונתון לטיהור בשיטת ההדרגתית סוכרוז. לאחר הטיהור, מספר oHSV זיהומיות (המיועד כיחידות יוצרות פלאק או PFUs) נקבע על ידי “פלאק assay” בתאי Vero. הפרוטוקול המתואר בזאת יכול לשמש להכנת מלאי oHSV גבוה טיטר למחקרים במבחנה בתרבית התא בניסויים בבעלי חיים vivo.
Introduction
וירוסים אונקוליטיים (OVs) הם צורה מתפתחת וייחודית של אימונותרפיה של סרטן. OVs לשכפל באופן סלקטיבי תאים סרטניים lyse (חוסך תאים נורמליים / בריאים)1 תוך גרימת חסינות אנטי גידול2. וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי (oHSV) הוא אחד הווירוסים שנחקרו בהרחבה ביותר בקרב כל OVs. זה הרחוק ביותר יחד במרפאה, עם Talimogene laherparepvec (T-VEC) להיות OV הראשון והיחיד לקבל אישור ה-FDA בארה”ב לטיפול במלנומה מתקדמת3. בנוסף ל- T-VEC, oHSVs מהונדסיםגנטיתרבים אחרים נבדקים באופן פרה-קליני וקליני בסוגי סרטן שונים 3,4,5,6,7,8. הביוטכנולוגיה הנוכחית המתקדמת של דנ”א רקומביננטי הגדילה עוד יותר את ההיתכנות של קידוד oHSVs חדש עבור transgene(s)טיפולית 3,5. מערכת יעילה של התפשטות oHSV, טיהור, וקביעת טיטר הוא קריטי לפני כל (שפותח לאחרונה) oHSV ניתן לבדוק במבחנה ובמחקרים vivo. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה צעד אחר צעד של צמיחת oHSV (בתאי Vero), טיהור (בשיטת ההדרגתית של סוכרוז) ו titration (על ידי בדיקת לוח oHSV בתאי Vero) (איור 1). זה יכול להיות מאומץ בקלות בכל Biosafety רמה 2 (BSL2) הגדרת מעבדה כדי להשיג מלאי ויראלי באיכות גבוהה למחקרים פרה-קוליניים.
ורו, קו תאי כליה של קוף ירוק אפריקאי, הוא קו התאים הנפוץ ביותר להפצת oHSV9,10,11,12,13 כמו תאי Vero יש מסלול איתות אנטי ויראלי פגום14. קווי תאים אחרים עם גירוי מומת של גנים אינטרפרון (STING) איתות יכול לשמש גם לצמיחה oHSV12,13. פרוטוקול זה מנצל תאי Vero לצמיחה oHSV ו פלאק assay. לאחר התפשטות, תאים נגועים oHSV נקצרים, lysed, ונתון לטיהור, שבו תאים lysed מטופלים תחילה עם גרעין בנזונזה כדי להשפיל את ה-DNA של התא המארח, למנוע הצטברות חומצה גרעינית חלבון, ולהפחית את הצמיגות של ליסט התא. כמו הפעלה נכונה של בנזונאס לעתים קרובות דורש Mg2+, 1-2 mM MgCl2 משמש בפרוטוקול זה15. פסולת התא המארח מן lysate התא שטופלו בנזונז הוא בוטל עוד יותר על ידי סינון סדרתי לפני צנטריפוגה במהירות גבוהה סוכרוז שיפוע. כרית פתרון סוכרוז צמיג 25% מסייעת להבטיח קצב איטי יותר של נדידת וירוסים דרך שכבת סוכרוז, משאיר רכיבים הקשורים לתא המארח ב supernatant, ובכך לשפר את הטיהור והגבלת אובדן וירוסים גלולה16. oHSV מטוהרים לאחר מכן titrated על תאים Vero, לוחות ויראליים הם דמיינו על ידי Giemsa מכתים17 או X-gal כתמים (עבור LacZ קידוד oHSVs)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול מתחיל עם הצמיחה של oHSV בתאי Vero מעבר נמוך. המפגש של monolayer תא Vero צריך להיות ~ 80% בזמן חיסון וירוס כמו תאים מגודלים יכולים לפתח מבנים סיביים הדוקים שיכולים להפחית את כניסת oHSV לתאי Vero20. לאחר 90-100% CPE נצפתה, supernatant התרבות מוסרת, תאים נקצרים, respended ב VB / supernatant (ראה שלב 1.4.6), הצמד קפו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר במעבדת סאהא נתמך בחלקו על ידי קרנות ממשרד המשפטים (W81XWH-20-1-0702) וקרן דודג’ ג’ונס-אבילין. סמואל ד. רבקין ומליסה ר.M האמפרי נתמכו חלקית על ידי NIH (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
