Wachstum, Reinigung und Titration des onkolytischen Herpes-Simplex-Virus
Summary
In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Methode des Wachstums, der Reinigung und der Titration des onkolytischen Herpes-simplex-Virus für die präklinische Anwendung.
Abstract
Onkolytische Viren (OVs), wie das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV), sind eine schnell wachsende Behandlungsstrategie im Bereich der Krebsimmuntherapie. OVs, einschließlich oHSV, replizieren sich selektiv in Krebszellen und töten sie ab (schonen gesunde / normale Zellen), während sie eine Anti-Tumor-Immunität induzieren. Aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaften werden oHSV-basierte Behandlungsstrategien zunehmend präklinisch und klinisch zur Behandlung von Krebs eingesetzt, einschließlich des von der FDA zugelassenen Talimogens Laherparevec (T-Vec). Wachstum, Reinigung und Titration sind drei wesentliche Labortechniken für alle OVs, einschließlich oHSVs, bevor sie für experimentelle Studien verwendet werden können. Dieses Papier beschreibt eine einfache Schritt-für-Schritt-Methode zur Verstärkung von oHSV in Vero-Zellen. Wenn sich oHSVs vermehren, erzeugen sie einen zytopathischen Effekt (CPE) in Vero-Zellen. Sobald 90-100% der infizierten Zellen eine CPE aufweisen, werden sie schonend geerntet, mit Benzonase und Magnesiumchlorid(MgCl2)behandelt, filtriert und mit der Saccharose-Gradienten-Methode gereinigt. Nach der Reinigung wird die Anzahl der infektiösen oHSV (als Plaque-bildende Einheiten oder PFUs bezeichnet) durch einen “Plaque-Assay” in Vero-Zellen bestimmt. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um hochtitere oHSV-Bestände für In-vitro-Studien in Zellkultur und in vivo Tierversuchen vorzubereiten.
Introduction
Onkolytische Viren (OVs) sind eine aufkommende und einzigartige Form der Krebsimmuntherapie. OVs replizieren sich selektiv in tumoren Zellen und lysieren sie (schonen normale/gesunde Zellen)1 und induzieren gleichzeitig eine Antitumorimmunität2. Das onkolytische Herpes-simplex-Virus (oHSV) ist eines der am umfangreichsten untersuchten Viren unter allen OVs. Talimogene Laherparepvec (T-VEC) ist die erste und einzige OV, die in den USA die FDA-Zulassung für die Behandlung des fortgeschrittenen Melanoms3erhalten hat. Neben T-VEC werden viele weitere gentechnisch veränderte oHSVs präklinisch und klinisch bei verschiedenen Krebsarten3,4,5,6,7, 8getestet. Die derzeitige fortgeschrittene rekombinante DNA-Biotechnologie hat die Machbarkeit der Entwicklung neuer oHSVs, die für therapeutische Transgene kodieren, weiter erhöht3,5. Ein effizientes System der oHSV-Vermehrung, -Aufreinigung und -bestimmung ist entscheidend, bevor ein (neu entwickeltes) oHSV für In-vitro- und In-vivo-Studien getestet werden kann. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Schritt-für-Schritt-Methode des oHSV-Wachstums (in Vero-Zellen), der Reinigung (durch die Saccharose-Gradienten-Methode) und der Titration (durch einen oHSV-Plaque-Assay in Vero-Zellen) (Abbildung 1). Es kann leicht in jedem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) eingesetzt werden, um einen qualitativ hochwertigen Virusbestand für präklinische Studien zu erhalten.
Vero, eine afrikanische grüne Affennierenzelllinie, ist die am häufigsten verwendete Zelllinie für die oHSV-Vermehrung9,10,11,12,13, da Vero-Zellen einen defekten antiviralen Interferon-Signalweg haben14. Andere Zelllinien mit inaktiviertem Stimulator der Interferon-Gene (STING) signalisierung können auch für das oHSV-Wachstum verwendet werden12,13. Dieses Protokoll verwendet Vero-Zellen für oHSV-Wachstum und Plaque-Assay. Nach der Vermehrung werden oHSV-infizierte Zellen geerntet, lysiert und einer Reinigung unterzogen, wobei lysierte Zellen zuerst mit Benzonase-Nuklease behandelt werden, um die DNA der Wirtszelle abzubauen, die Nukleinsäure-Protein-Aggregation zu verhindern und die Viskosität des Zelllysats zu reduzieren. Da die ordnungsgemäße Aktivierung der Benzonase oft Mg2+erfordert, werden in diesem Protokoll15 1-2mM MgCl2 verwendet. Die Wirtszellreste aus dem mit Benzonase behandelten Zelllysat werden durch serielle Filtration vor der Hochgeschwindigkeits-Saccharose-Gradientenzentrifugation weiter eliminiert. Ein viskoses 25%iges Saccharoselösungskissen trägt dazu bei, eine langsamere Virusmigration durch die Saccharoseschicht zu gewährleisten, wobei wirtszellbezogene Komponenten im Überstand belassen werden, wodurch die Reinigung verbessert und der Virusverlust im Pelletbegrenzt wird 16. Das gereinigte oHSV wird dann auf Vero-Zellen titriert, und virale Plaques werden durch Giemsa-Färbung17 oder X-Gal-Färbung (für LacZ-kodierende oHSVs)18visualisiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll beginnt mit dem Wachstum von oHSV in Vero-Zellen mit niedriger Passage. Die Konfluenz der Vero-Zellmonoschicht sollte zum Zeitpunkt der Virusimpfung ~ 80% betragen, da überwachsene Zellen enge faserige Strukturen entwickeln können, die den Eintritt von oHSV in Vero-Zellen reduzieren können20. Sobald 90-100% CPE beobachtet wurde, wird der Kulturüberstand entfernt, Zellen geerntet, in VB/Überstand resuspendiert (siehe Schritt 1.4.6), einrastig eingefroren und bei -80 °C zur spät…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung im Saha-Labor wurde teilweise durch Mittel des DOD (W81XWH-20-1-0702) und der Dodge Jones Foundation-Abilene unterstützt. Samuel D. Rabkin und Melissa R.M. Humphrey wurden teilweise von NIH unterstützt (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
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