Croissance, purification et titrage du virus oncolytique de l’herpès simplex
Summary
Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode simple de croissance, de purification, et de titrage du virus oncolytique de simplex d’herpès pour l’usage préclinique.
Abstract
Les virus oncolytiques (OV), tels que le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV), sont une stratégie de traitement en croissance rapide dans le domaine de l’immunothérapie du cancer. Les VQ, y compris le VSS O, se répliquent sélectivement dans les cellules cancéreuses et les tuent (épargnant les cellules saines/normales) tout en induisant une immunité antitumorale. En raison de ces propriétés uniques, les stratégies de traitement basées sur le vHS OHS sont de plus en plus utilisées pour le traitement du cancer, précliniquement et cliniquement, y compris le talimogene laherparevec (T-Vec) approuvé par la FDA. La croissance, la purification et le titrage sont trois techniques de laboratoire essentielles pour tout OV, y compris les VHSO, avant qu’ils ne puissent être utilisés pour des études expérimentales. Cet article décrit une méthode simple étape par étape pour amplifier l’oHSV en cellules de Vero. À mesure que les vhso se multiplient, ils produisent un effet cytopathique (CPE) dans les cellules vero. Une fois que 90-100% des cellules infectées montrent un CPE, elles sont doucement récoltées, traitées avec de la benzonase et du chlorure de magnésium (MgCl2),filtrées, et soumises à la purification utilisant la méthode de saccharose-gradient. Après purification, le nombre d’oHSV infectieux (désigné comme unités formant plaque ou PPU) est déterminé par un « test de plaque » dans les cellules Vero. Le protocole décrit ici peut être employé pour préparer le stock d’oHSV de haut-titre pour des études in vitro dans la culture cellulaire et les expériences in vivo d’animal.
Introduction
Les virus oncolytiques (VE) sont une forme émergente et unique d’immunothérapie du cancer. Les OV se répliquent sélectivement dans les cellules tumorales et les lysent (épargnant les cellules normales/saines)1 tout en induisant une immunité antitumorale2. Le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV) est l’un des virus les plus étudiés parmi tous les OVs. Il est le plus avancé dans la clinique, talimogene laherparepvec (T-VEC) étant le premier et le seul OV à recevoir l’approbation de la FDA aux États-Unis pour le traitement du mélanome avancé3. En plus du T-VEC, de nombreux autres oHSVs génétiquement modifiés sont testés précliniquement et cliniquement dans différents types de cancer3,4,5,6,7,8. La biotechnologie avancée actuelle de l’ADN recombinant a encore augmenté la faisabilité de l’ingénierie de nouveaux oHSVs codant pour le(s) transgène(s) thérapeutique(s)3,5. Un système efficace de propagation, de purification et de détermination du titre de l’oHSV est essentiel avant qu’un oHSV (nouvellement développé) puisse être testé pour des études in vitro et in vivo. Cet article décrit une méthode simple étape par étape de croissance de l’oHSV (dans les cellules vero), de purification (par la méthode de gradient de saccharose) et de titrage (par un dosage de plaque de l’oHSV dans les cellules de Vero)(Figure 1). Il peut être facilement adopté dans n’importe quel laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) pour obtenir un stock viral de haute qualité pour les études précliniques.
Vero, une lignée cellulaire de rein de singe vert africain, est la lignée cellulaire la plus couramment utilisée pour la propagation de l’oHSV9,10,11,12, 13carles cellules Vero ont une voie de signalisation antivirale d’interférondéfectueuse 14. D’autres lignées cellulaires avec stimulateur inactivé des gènes d’interféron (STING) signalisation peuvent également être utilisés pour la croissance de l’oHSV12,13. Ce protocole utilise des cellules Vero pour la croissance d’oHSV et l’analyse de plaque. Après la propagation, les cellules infectées par le vHSo sont récoltées, lysées et soumises à une purification, dans laquelle les cellules lysées sont d’abord traitées avec de la nucléase benzonase pour dégrader l’ADN de la cellule hôte, empêcher l’agrégation acide nucléique-protéine et réduire la viscosité du lysat cellulaire. Comme l’activation correcte de la benzonase nécessite souventmg2+,1-2 mMMgCl2 est utilisé dans ce protocole15. Les débris de cellules hôtes du lysat de cellules benzonase-traités sont en outre éliminés par filtration en série avant la centrifugation à gradient de saccharose à grande vitesse. Un coussin visqueux de solution de saccharose à 25% aide à assurer un taux de migration plus lent du virus à travers la couche de saccharose, laissant les composants liés à la cellule hôte dans le surnageant, améliorant ainsi la purification et limitant la perte de virus dans la pastille16. L’oHSV purifié est ensuite titré sur les cellules Vero, et les plaques virales sont visualisées par coloration Giemsa17 ou coloration X-gal (pour lacZ codant oHSVs)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole commence par la croissance de l’oHSV dans les cellules Vero à faible passage. La confluence de la monocouche de cellules Vero devrait être d’environ 80% au moment de l’inoculation du virus, car les cellules envahies par la prolifération peuvent développer des structures fibreuses serrées qui peuvent réduire l’entrée de l’oHSV dans les cellules vero20. Une fois que 90-100% CPE est observé, le surnageant de culture est retiré, les cellules sont récoltées, remises en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche dans le laboratoire Saha a été financée en partie par des fonds du DOD (W81XWH-20-1-0702) et de la Fondation Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin et Melissa R.M. Humphrey ont été partiellement soutenus par les NIH (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
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