Groei, zuivering en titratie van oncolytisch herpes simplexvirus
Summary
In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige methode van groei, zuivering en titratie van het oncolytische herpes simplex-virus voor preklinisch gebruik.
Abstract
Oncolytische virussen (OV’s), zoals het oncolytische herpes simplex-virus (oHSV), zijn een snel groeiende behandelingsstrategie op het gebied van kankerimmunotherapie. OP’s, waaronder oHSV, repliceren selectief in en doden kankercellen (sparen gezonde/normale cellen) terwijl ze antitumorimmuniteit induceren. Vanwege deze unieke eigenschappen worden oHSV-gebaseerde behandelingsstrategieën steeds vaker gebruikt voor de behandeling van kanker, preklinisch en klinisch, waaronder fda-goedgekeurde talimogene laherparevec (T-Vec). Groei, zuivering en titratie zijn drie essentiële laboratoriumtechnieken voor alle OVs, inclusief oHSV’s, voordat ze kunnen worden gebruikt voor experimentele studies. Dit artikel beschrijft een eenvoudige stapsgewijze methode om oHSV in Vero-cellen te versterken. Naarmate oHSV’s zich vermenigvuldigen, produceren ze een cytopathisch effect (CPE) in Vero-cellen. Zodra 90-100% van de geïnfecteerde cellen een CPE vertonen, worden ze voorzichtig geoogst, behandeld met benzonase en magnesiumchloride (MgCl2),gefilterd en onderworpen aan zuivering met behulp van de sucrose-gradiëntmethode. Na zuivering wordt het aantal infectieuze oHSV (aangeduid als plaquevormende eenheden of PFUs) bepaald door een “plaquetest” in Vero-cellen. Het hierin beschreven protocol kan worden gebruikt om hoog-titer oHSV-voorraad voor te bereiden op in vitro studies in celkweek en in vivo dierproeven.
Introduction
Oncolytische virussen (OV’s) zijn een opkomende en unieke vorm van kankerimmunotherapie. OP’s repliceren selectief tumorcellen in en lyse (sparende normale/gezonde cellen)1 terwijl ze antitumorimmuniteit induceren2. Oncolytisch herpes simplex-virus (oHSV) is een van de meest uitgebreid bestudeerde virussen onder alle OV’s. Het is het verst in de kliniek, met Talimogene laherparepvec (T-VEC) als eerste en enige OV die FDA-goedkeuring in de VS heeft ontvangen voor de behandeling van gevorderd melanoom3. Naast T-VEC worden veel andere genetisch gemanipuleerde oHSV’s preklinisch en klinisch getest bij verschillende kankertypen3,4,5,6,7,8. De huidige geavanceerde recombinante DNA-biotechnologie heeft de haalbaarheid van de engineering van nieuwe oHSV’s voor therapeutische transgene(n)3,5verder vergroot . Een efficiënt systeem van oHSV propagatie, zuivering en titer bepaling is van cruciaal belang voordat een (nieuw ontwikkelde) oHSV kan worden getest voor in vitro en in vivo studies. Dit artikel beschrijft een eenvoudige stapsgewijze methode van oHSV-groei (in Vero-cellen), zuivering (volgens de sucrose-gradiëntmethode) en titratie (door een oHSV-plaquetest in Vero-cellen) (Figuur 1). Het kan gemakkelijk worden aangenomen in elke bioveiligheid niveau 2 (BSL2) laboratoriuminstelling om een hoogwaardige virale voorraad voor preklinische studies te bereiken.
Vero, een Afrikaanse groene apenniercellijn, is de meest gebruikte cellijn voor oHSV-propagatie9,10,11,12,13 omdat Vero-cellen een defecte antivirale interferonsignaleringsroute hebben14. Andere cellijnen met inactivated stimulator of interferon genes (STING) signalering kunnen ook worden gebruikt voor oHSV-groei12,13. Dit protocol maakt gebruik van Vero-cellen voor oHSV-groei en plaquetest. Na vermeerdering worden met oHSV geïnfecteerde cellen geoogst, gelyseerd en onderworpen aan zuivering, waarbij gelyseerde cellen eerst worden behandeld met benzonasenuclease om gastheercel-DNA af te doen, nucleïnezuur-eiwitaggregatie te voorkomen en de viscositeit van het cellysaat te verminderen. Aangezien een goede activering van benzonase vaak Mg2+vereist , wordt in dit protocol mgCl2 1-2 mM MgCl2gebruikt . Het gastheercelresten van het met benzonase behandelde cellysaat worden verder geëlimineerd door seriële filtratie vóór snelle sucrose-gradiëntcentrifugatie. Een stroperig 25% sucrose-oplossingskussen helpt om een langzamere virusmigratie door de sacharoselaag te garanderen, waardoor gastheercelgerelateerde componenten in het supernatant achterblijven, waardoor de zuivering wordt verbeterd en virusverlies in de pellet wordt beperkt16. De gezuiverde oHSV wordt vervolgens getitreerd op Vero-cellen en virale plaques worden gevisualiseerd door Giemsa-kleuring17 of X-gal-kleuring (voor LacZ-codering van oHSV’s)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol begint met de groei van oHSV in low-passage Vero cellen. De samenvloeiing van de Vero-celmonolaag moet ~ 80% zijn op het moment van virusinenting, omdat overwoekerde cellen strakke vezelige structuren kunnen ontwikkelen die de oHSV-invoer in Vero-cellen kunnen verminderen20. Zodra 90-100% CPE is waargenomen, wordt het kweeksupernatant verwijderd, cellen geoogst, geresuspendeerd in VB/supernatant (zie stap 1.4.6), snap-frozen en opgeslagen bij -80 °C voor latere zuivering. Blaho en co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek in het Saha lab werd mede ondersteund door fondsen van de DOD (W81XWH-20-1-0702) en Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin en Melissa R.M. Humphrey werden gedeeltelijk ondersteund door NIH (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
