نمو وتنقية وتكرير فيروس الهربس البسيط Oncolytic
Summary
في هذه المخطوطة، نقوم بوصف طريقة بسيطة للنمو والتنقية والتكرير لفيروس الهربس البسيط oncolytic للاستخدام قبل السريري.
Abstract
الفيروسات الأورام (OVs)، مثل فيروس الهربس البسيط oncolytic (oHSV)، هي استراتيجية علاج سريعة النمو في مجال العلاج المناعي للسرطان. OVs، بما في ذلك oHSV، تكرار انتقائي في وقتل الخلايا السرطانية (تجنيب الخلايا السليمة / الطبيعية) في حين حفز المناعة المضادة للورم. وبسبب هذه الخصائص الفريدة، يتم استخدام استراتيجيات العلاج القائمة على oHSV بشكل متزايد لعلاج السرطان، قبل السريرية وسريريا، بما في ذلك talimogene laherparevec المعتمدة من إدارة الأغذية والعقاقير (T-Vec). النمو والتنقية والتكرير هي ثلاث تقنيات مختبرية أساسية لأي OVs ، بما في ذلك oHSVs ، قبل أن يمكن استخدامها للدراسات التجريبية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة خطوة بخطوة لتضخيم oHSV في خلايا Vero. كما oHSVs تتكاثر، فإنها تنتج تأثير cytopathic (CPE) في خلايا Vero. مرة واحدة 90-100٪ من الخلايا المصابة تظهر CPE، يتم حصادها بلطف، تعامل مع البنزوناز وكلوريد المغنيسيوم (MgCl2)،وتصفيتها، وتعرض للتنقية باستخدام طريقة السكروز التدرج. بعد تنقية، يتم تحديد عدد oHSV المعدية (المعينة كوحدات تشكيل البلاك أو PFUs) من خلال “فحص البلاك” في خلايا Vero. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لإعداد مخزون oHSV عالي التأر للدراسات المختبرية في زراعة الخلايا وفي التجارب الحيوانية الحية.
Introduction
الفيروسات الأورام (OVs) هي شكل ناشئ وفريد من أشكال العلاج المناعي للسرطان. OVs تكرار انتقائي في وlyse الخلايا السرطانية (تجنيب الخلايا الطبيعية / السليمة)1 في حين حفز مناعة مضادة للورم2. فيروس الهربس البسيط Oncolytic (oHSV) هو واحد من الفيروسات الأكثر دراسة على نطاق واسع بين جميع OVs. هو أبعد على طول في العيادة, مع Talimogene laherparepvec (T-VEC) كونها OV الأولى والوحيدة التي تتلقى موافقة ادارة الاغذية والعقاقير في الولايات المتحدة لعلاج سرطان الجلد المتقدمة3. بالإضافة إلى T-VEC، يتم اختبار العديد من oHSVs الأخرى المعدلة وراثيا قبل السريرية وسريريا في أنواع السرطان المختلفة3،4،5،6،7،8. وقد زادت التكنولوجيا الحيوية المتقدمة الحالية الحمض النووي المؤتلف من جدوى هندسة جديدة oHSVs الترميز لtransgene العلاجية (ق)3،5. يعد وجود نظام فعال لنشر oHSV وتنقية وتأليف التيتر أمرا بالغ الأهمية قبل أن يتم اختبار أي oHSV (تم تطويره حديثا) في المختبر وفي الدراسات الحية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة خطوة بخطوة لنمو oHSV (في خلايا Vero) ، والتنقية (عن طريق طريقة تدرج السكروز) ، والتكييف (بواسطة فحص لوحة oHSV في خلايا Vero) (الشكل 1). ويمكن اعتماده بسهولة في أي إعداد مختبري من المستوى 2 للسلامة البيولوجية (BSL2) لتحقيق مخزون فيروسي عالي الجودة للدراسات ما قبل السريرية.
Vero، وهو خط خلايا الكلى القرد الأخضر الأفريقي، هو خط الخلية الأكثر استخداما لنشر oHSV9،10،11،12،13 كما خلايا فيرو لديها معيبة المضادة للفيروسات الانترفيرون إشارة المسار14. خطوط الخلايا الأخرى مع محفز معطل من جينات الإنترفيرون (STING) الإشارات يمكن أيضا أن تستخدم لنمو oHSV12,13. يستخدم هذا البروتوكول خلايا Vero لنمو oHSV و المقايسة البلاك. بعد الانتشار، يتم حصاد الخلايا المصابة ب oHSV، والتحلل، وتعرض للتنقية، حيث يتم التعامل مع الخلايا المتحللة أولا بنوكلياز البنزونازي لإضعاف الحمض النووي للخلية المضيفة، ومنع تراكم البروتين الحمضي النووي، والحد من لزوجة ليسات الخلية. كما التنشيط السليم للبنزوناز غالبا ما يتطلب ملغ2 +, 1-2 M MgCl2 يستخدم في هذا البروتوكول15. يتم التخلص من حطام الخلية المضيفة من ليسات الخلية المعالجة بالبنزوناز عن طريق الترشيح التسلسلي قبل الطرد المركزي عالي السرعة من السكروز المتدرجة. يساعد وسادة محلول السكروز اللزجة بنسبة 25٪ على ضمان معدل أبطأ لهجرة الفيروس من خلال طبقة السكروز ، تاركا المكونات المرتبطة بالخلية المضيفة في الفائقة ، وبالتالي تحسين تنقية والحد من فقدان الفيروس في بيليه16. ثم يتم titrated oHSV المنقى على خلايا Vero ، ويتم تصور لويحات الفيروسية من قبل Giemsaتلطيخ 17 أو X-gal تلطيخ (لترميز LacZ oHSVs)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
يبدأ البروتوكول بنمو oHSV في خلايا Vero منخفضة المرور. يجب أن يكون التقاء أحادي الطبقة الخلية Vero ~ 80٪ في وقت تلقيح الفيروسات كما يمكن للخلايا المتضخمة تطوير هياكل ليفية ضيقة يمكن أن تقلل من دخول oHSV إلى خلايا Vero20. مرة واحدة لوحظ 90-100٪ CPE، تتم إزالة الطبيعة الثقافية، يتم حصاد الخلايا، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الأبحاث في مختبر ساها جزئيا بأموال من إدارة المكافحة (W81XWH-20-1-0702) ومؤسسة دودج جونز-أبيلين. صموئيل د. رابكين وميليسا ر.M همفري كانا مدعومين جزئيا من قبل المعاهد القومية للصحة (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
