Vektörlü Gen Teslimatı için İnsan Olmayan Bir Primatta Stensen Kanalı aracılığıyla Retrograd Parotid Bezi İnfüzyonu
Summary
Tükürük bezleri, özellikle gen transferi ile aşılama alanında gen tedavisi için doku hedef bölgesi olarak önerilmiştir. Retrograd parotis infüzyonu kullanarak insan olmayan bir primat modelinde gen iletimi gösteriyoruz.
Abstract
Tükürük bezleri gen tedavisi için çekici bir doku hedefidir ve umut verici sonuçlar zaten insan deneylerine yol açıpmaktadır. Doğal olarak kan dolaşımına protein salgılayabilirler ve kolayca erişilebilirler, bu da onları gen transferi ile hormon üretimi veya aşılanması için potansiyel olarak üstün doku bölgeleri haline getirir. Gen iletimi için önerilen yöntemler arasında transkütan enjeksiyon ve tükürük kanalları yoluyla retrograd infüzyon bulunur. İnsan olmayan primatlarda Retrograd Tükürük Bezi İnfüzyonunun (RSGI) nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz. Temel diş aletleri, polietilen boru ve siyanoakrilat kullanarak Stensen Kanalı’nı kanüle etmek ve sızdırmaz hale getirebilir atraumatik bir yöntem olan parotis papillanın tanımlanması ve uygun infüzyon oranı da dahil olmak üzere önemli anatomik simgesel yapıları açıklıyoruz. Bu en az travmatik doğum yöntemi olmakla birlikte, yöntem hala teslim edilebilen hacim (<0,5 mL) ve kanal ve bezde travma potansiyeli ile sınırlıdır. Floroskopi kullanarak bir infüzyonun beze tam olarak teslim edilebileceğini gösteriyoruz ve immünhistokimya ile tipik bir vektörün transdüksiyonunun ve verilen genin ekspresyonunun daha da gösterileceğini gösteriyoruz.
Introduction
Tükürük bezleri tükürük ekzokrin üretimi ile iyi bilinirken, araştırmacılar proteinleri doğrudan kan dolaşımına salgılama yeteneklerini uzun zamandır fark etmişlerdir 1 , bu da onları yedek hormonlar veya antikor üretimi gibi sistemik uygulama için gen tedavisi için potansiyel bir hedefhalinegetirmektedir. Aslında, tükürük bezleri, salgı için protein üretme yeteneği (bir özellik kaslarının eksikliği), vektör difüzyonunu sınırlandırabilen ağır kapsülleme ve entegre olmayan vektörler için stabilite sağlayan iyi ayırt edilmiş doku gibi diğer doku hedeflerine göre çeşitli avantajlar sunar. Ayrıca, ciddi bir olumsuz olay durumunda, tükürük bezleri yaşam için kritik değildir ve cerrahi olarak çıkarılabilir. Hemen sezgisel olmasa da, parotis bezlerine ana boşaltım kanalı olan Stensen’s Duct2aracılığıyla ağızdan kolayca erişilebilir.
Tükürük dokusunun gen tedavisi için avantajları göz önüne alındığında, bu doku hedefini keşfetmeye olan ilgi artmaktadır. Kemirgen, köpek ve insan dışı primat modellerinde çok sayıda çalışma zaten yapıldı ve en az bir insan klinik çalışması devam ediyor3,4,5. Gen tedavisi amacıyla bu doku hedefinin yararını daha fazla araştırmak ve geliştirmek için daha fazla insan dışı primat çalışması yapılması gerekecektir. Bu makalede, insan olmayan primat modelinde transdüksiyon için vektörel bir gen sunmak için Stensen Kanalı aracılığıyla parotis bezlerine erişmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İnfüzyonun doğumunun ve kanalın beze girerken anatomisinin gözle görülür bir şekilde ortaya konmasını sağlamak için radyokontrast kullanılarak floroskopi yapıldı. Bir vektörün başarılı bir şekilde transdüksiyonunun ortaya konması için Adenovirüs serotip 5 (Ad5) vektörlü egfp geni kullanılmıştır. Ad5 tükürük dokusunu transdükleyebilen iyi tanımlanmış bir vektördür. Nihai klinik kullanım için çok immünojenik olmasına rağmen, verimli transdüksiyon sağlamak için bu gösteri çalışması için bir Ad5 vektörü seçilmiştir. Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein (EGFP) üretiminin değerlendirilmesi, transdüksiyondan sonra vektörel bir genin başarılı transkripsiyonunu ve çevirisini göstermek için iyi tanımlanmış bir yöntemdir ve burada yapılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, Stensen Kanalı aracılığıyla parotis bezine retrograd infüzyon protokolünü açıklıyoruz. Açıklanan metodoloji, gen tedavisi ve diğer uygulamalar için bir alan olarak tükürük dokusunun yararını araştıran araştırmacılar tarafından potansiyel olarak kullanılabilecek rehberlik sunmaktadır.
Yordamın başarısını sağlamak için birden çok kritik adım vardır. Her şeyden önce, tüm prosedür adımları nazikçe tamamlanmalıdır. Ağzın güçlü bir şekilde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Prosedürün filme alınmasındaki görsel-işitsel desteği için Bay Cagney Gentry’ye teşekkür etmek istiyorlar. Ayrıca, bu projenin takibinde akademik destek için Hefner VA tıp merkezini de kabul etmek istiyoruz.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
