Ретроградная инфузия рядовидной железы через проток Стенсена у нечеловеческого примата для векторной доставки генов
Summary
Слюнные железы были предложены в качестве тканевого целевого участка для генной терапии, особенно в области вакцинации путем переноса генов. Мы демонстрируем доставку генов в модели нечеловеческих приматов, использующей ретроградную инфузию прилежащей артерии.
Abstract
Слюнные железы являются привлекательной тканевой мишенью для генной терапии с многообещающими результатами, уже приводящими к испытаниям на людях. Они по своей природе способны секретить белки в кровоток и легко доступны, что делает их потенциально превосходными тканевыми участками для производства замещающих гормонов или вакцинации путем переноса генов. Предлагаемые методы доставки генов включают чрескожную инъекцию и ретроградную инфузию через слюнные протоки. Мы демонстрируем, как выполнять ретроградную инфузию слюнных желез (RSGI) у нечеловеческих приматов. Мы описываем важные анатомические ориентиры, включая идентификацию сосочка рядового, атравматический метод каннюляции и герметизации протока Стенсена с использованием основных стоматологических инструментов, полиэтиленовых трубок и цианоакрилата, а также соответствующую скорость инфузии. Хотя это наименее травматичный метод доставки, метод по-прежнему ограничен объемом, который может быть доставлен (<0,5 мл) и возможностью травмирования протока и железы. Мы демонстрируем с помощью рентгеноскопии, что инфузия может быть полностью доставлена в железу, и дополнительно демонстрируем иммуногистохимией трансдукцию типичного вектора и экспрессию доставленного гена.
Introduction
В то время как слюнные железы хорошо известны своей экзокринной выработкой слюны, исследователи давно признали их способность секретировать белки непосредственно в кровоток1,что делает их потенциальной мишенью для генной терапии для системного введения, такого как заместительные гормоны или выработка антител. Фактически, слюнные железы предлагают несколько преимуществ по сравнению с другими тканевыми мишенями, такими как врожденная способность производить белки для секреции (недостаток свойств мышц), тяжелая инкапсуляция, которая может ограничить диффузию векторов, и хорошо дифференцированная ткань, обеспечивающая стабильность для неинтегрируемых векторов. Кроме того, в случае серьезного неблагоприятного события слюнные железы не являются критическими для жизни и могут быть удалены хирургическим путем. Хотя и не сразу интуитивно понятные, почтительные железы также легко доступны изо рта через их главный выделительный проток, проток Стенсена2.
Учитывая преимущества слюнной ткани для генной терапии, растет интерес к изучению этой тканевой мишени. Многочисленные исследования уже были проведены на моделях грызунов, соб и нечеловеческих приматов, и, по крайнеймере,одно клиническое испытание на людях проводится3,4,5. Для дальнейшего изучения и развития полезности этой тканевой мишени для целей генной терапии необходимо будет провести больше исследований приматов, не являющихся людьми. В этой статье описывается метод доступа к правоушным железам через проток Стенсена для доставки векторного гена трансдукции в модели нечеловеческих приматов. Чтобы наглядно продемонстрировать доставку инфузии и анатомию протока при его поступлении в железу, была проведена рентгеноскопия с использованием радиоконтраста. Для демонстрации успешной трансдукции вектора был использован векторный ген egfp серотипа Аденовируса 5 (Ad5). Ad5 является хорошо описанным вектором, способным пропускать слюноотделение. Хотя он слишком иммуногенен для конечного клинического использования, вектор Ad5 был выбран для этого демонстрационного исследования, чтобы обеспечить эффективную трансдукцию. Оценка производства улучшенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) является хорошо описанным методом демонстрации успешной транскрипции и трансляции векторного гена после трансдукции и была сделана здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протокол ретроградной инфузии в приушную железу через проток Стенсена. Описанная методология предлагает руководство, которое потенциально может быть использовано исследователями, изучающими полезность слюнной ткани в качестве места для генной терапии и других пр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотят поблагодарить г-на Кэгни Джентри за его аудиовизуальную поддержку в съемках процедуры. Мы также хотим поблагодарить медицинский центр Hefner VA за академическую поддержку в реализации этого проекта.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
