עירוי בלוטת פרוטידים מדרדר דרך צינור סטנסן בפרימט לא אנושי לאספקת גנים וקטורית
Summary
בלוטות הרוק הוצעו כאתר יעד לרקמות לטיפול גנטי, במיוחד בתחום החיסון על ידי העברת גנים. אנו מדגימים אספקת גנים במודל פרימטים לא אנושיים המשתמש בעירוי פרוטידים מדרדר.
Abstract
בלוטות הרוק הן יעד רקמות אטרקטיבי לטיפול גנטי עם תוצאות מבטיחות כבר מוביל לניסויים בבני אדם. הם מסוגלים מטבעם להפריש חלבונים למחזור הדם והם נגישים בקלות, מה שהופך אותם לאתרי רקמות מעולים פוטנציאליים לייצור הורמונים חלופיים או חיסון על ידי העברת גנים. שיטות מוצעות להעברת גנים כוללות הזרקה עורית ועירוי מדרדר דרך צינורות רוק. אנו מדגימים כיצד לבצע עירוי בלוטת הרוק מדרדר (RSGI) בפרימטים שאינם אנושיים. אנו מתארים את ציוני הדרך האנטומיים החשובים כולל זיהוי של הפפילה הפרוטידית, שיטה אטארומטית של שינון ואיטום צינור סטנסן תוך שימוש בכלים דנטליים בסיסיים, צינורות פוליאתילן ו cyanoacrylate, ואת השיעור המתאים של עירוי. אמנם זוהי שיטת המסירה הפחות טראומטית, אך השיטה עדיין מוגבלת על ידי הנפח המסוגלת להימסר (<0.5 מ"ל) והפוטנציאל לטראומה לצינור ובבלוטות. אנו מדגימים באמצעות פלואורוסקופיה כי אינפוזאט יכול להיות מועבר באופן מלא לתוך הבלוטה, ולהדגים עוד יותר על ידי אימונוהיסטוכימיה את transduction של וקטור טיפוסי ביטוי של הגן נמסר.
Introduction
בעוד בלוטות הרוק ידועים בייצור האקסוקריני שלהם של רוק, חוקרים מזה זמן רב זיהו את יכולתם להפריש חלבונים ישירות למחזור הדם 1 , מהשהופךאותם למטרה פוטנציאלית לטיפול גנטי לניהול מערכתי, כגון הורמונים חלופיים או ייצור נוגדנים. למעשה, בלוטות הרוק מציעות מספר יתרונות על פני מטרות רקמות אחרות, כגון היכולת הטבועה לייצר חלבונים להפרשה (חסר שרירי רכוש), אנקפסולציה כבדה שיכולה להגביל דיפוזיה וקטורית, ורקמות מובחנות היטב המספקות יציבות לווקטורים שאינם משתלבים. יתר על כן, במקרה של אירוע לוואי חמור, בלוטות הרוק אינן קריטיות לחיים וניתן להסירן בניתוח. אמנם לא אינטואיטיבי מיד, בלוטות פרוטידים נגישים גם מהפה דרך צינור ההפרשה הראשי שלהם, צינור2של סטנסן .
בהתחשב ביתרונות של רקמת הרוק לטיפול גנטי, יש עניין גובר לחקור את יעד הרקמה הזה. מחקרים רבים כבר בוצעו במודלים של מכרסמים, כלבים ופרימטים לא אנושיים ולפחות ניסוי קליני אחד בבני אדם נמצא בעיצומו3,4,5. כדי להמשיך לחקור ולפתח את התועלת של יעד רקמות זה למטרות ריפוי גנטי, יותר מחקרים פרימטים שאינם אנושיים יצטרכו להתבצע. מאמר זה מתאר שיטה לגישה לבלוטות הפרוטידים דרך צינור סטנסן כדי לספק גן וקטורי להחלפת מודל הפרימטים הלא אנושי. כדי להדגים באופן ניכר את המסירה של infusate ואת האנטומיה של הצינור כפי שהוא נכנס בלוטה, פלואורוסקופיה באמצעות radiocontrast בוצע. כדי להדגים טרנסולציה מוצלחת של וקטור, נעשה שימוש בגן egfp וקטורי של אדנווירוס 5 (Ad5). Ad5 הוא וקטור מתואר היטב המסוגל לבצע חילוף של רקמת רוק. למרות שזה אימונוגני מדי לשימוש קליני אולטימטיבי, וקטור Ad5 נבחר למחקר הדגמה זה כדי להבטיח טרנסולמה יעילה. הערכת ייצור חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) היא שיטה המתוארת היטב כדי להדגים שעתוק ותרגום מוצלחים של גן וקטורי לאחר התמרה ונעשה כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול של עירוי מדרדר לתוך בלוטת הפרוטיד דרך צינור סטנסן. המתודולוגיה המתוארת מציעה הדרכה שיכולה לשמש חוקרים החוקרים את התועלת של רקמת הרוק כאתר לטיפול גנטי ויישומים אחרים.
ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח את הצלחת ההליך. בראש ובראשונה, יש להשלים בעדינות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות למר קגני ג’נטרי על תמיכתו האודיו-קולית בצילומי ההליך. אנחנו גם רוצים להכיר במרכז הרפואי הפנר VA לתמיכה אקדמית במרדף אחר פרויקט זה.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
