Retrograde Ohrspeicheldrüseninfusion durch Stensen-Kanal in einem nicht-menschlichen Primaten für vektorierte Genabgabe
Summary
Speicheldrüsen wurden als Gewebezielstelle für die Gentherapie vorgeschlagen, insbesondere im Bereich der Impfung durch Gentransfer. Wir demonstrieren die Genabgabe in einem nicht-menschlichen Primatenmodell mit retrograder Ohrspeicheldrüseninfusion.
Abstract
Speicheldrüsen sind ein attraktives Gewebeziel für die Gentherapie mit vielversprechenden Ergebnissen, die bereits zu Studien am Menschen führen. Sie sind von Natur aus in der Lage, Proteine in den Blutkreislauf zu sezernieren und sind leicht zugänglich, was sie potenziell überlegene Gewebestellen für die Ersatzhormonproduktion oder Impfung durch Gentransfer macht. Vorgeschlagene Methoden für die Genabgabe umfassen die transkutane Injektion und die retrograde Infusion durch Speichelgänge. Wir zeigen, wie retrograde Speicheldrüseninfusion (RSGI) bei nicht-menschlichen Primaten durchgeführt wird. Wir beschreiben die wichtigen anatomischen Orientierungspunkte, einschließlich der Identifizierung der Ohrspeicheldrüsenpapille, einer atraumatischen Methode zum Kanülieren und Versiegeln des Stensen-Kanals unter Verwendung grundlegender zahnärztlicher Werkzeuge, Polyethylenschläuche und Cyanacrylat sowie der entsprechenden Infusionsrate. Während dies die am wenigsten traumatische Methode der Entbindung ist, ist die Methode immer noch durch das Volumen begrenzt, das abgegeben werden kann (<0,5 ml) und das Potenzial für ein Trauma des Kanals und der Drüse. Wir zeigen mit Hilfe der Fluoroskopie, dass ein Infusat vollständig in die Drüse abgegeben werden kann, und zeigen durch Immunhistochemie die Transduktion eines typischen Vektors und die Expression des gelieferten Gens.
Introduction
Während Speicheldrüsen für ihre exokrine Speichelproduktion bekannt sind, haben Forscher seit langem ihre Fähigkeit erkannt, Proteine direkt in den Blutkreislauf 1 abzusondern, was sie zueinempotenziellen Ziel für die Gentherapie zur systemischen Verabreichung macht, wie Ersatzhormone oder Antikörperproduktion. Tatsächlich bieten Speicheldrüsen mehrere Vorteile gegenüber anderen Gewebezielen, wie die inhärente Fähigkeit, Proteine für die Sekretion zu produzieren (eine Eigenschaft, die Muskeln fehlt), eine starke Verkapselung, die die Vektordiffusion begrenzen kann, und gut differenziertes Gewebe, das Stabilität für nicht integrierende Vektoren bietet. Darüber hinaus sind Speicheldrüsen im Falle eines schwerwiegenden unerwünschten Ereignisses nicht lebenskritisch und können operativ entfernt werden. Obwohl nicht sofort intuitiv, sind Ohrspeicheldrüsen auch leicht vom Mund durch ihren Hauptausscheidungsgang, Stensens Duct2,zugänglich.
Angesichts der Vorteile von Speichelgewebe für die Gentherapie steigt das Interesse an der Erforschung dieses Gewebeziels. Zahlreiche Studien wurden bereits in Nagetier-, Hunde- und nicht-menschlichen Primatenmodellen durchgeführt, und mindestens eine klinische Studie am Menschen ist im Gange3,4,5. Um den Nutzen dieses Gewebeziels für Gentherapiezwecke weiter zu erforschen und zu entwickeln, müssen weitere nicht-menschliche Primatenstudien durchgeführt werden. Dieser Artikel beschreibt eine Methode für den Zugang zu den Ohrspeicheldrüsen durch Stensens Kanal, um ein vektoriertes Gen für die Transduktion im nicht-menschlichen Primatenmodell zu liefern. Um die Abgabe des Infusats und die Anatomie des Kanals beim Eintritt in die Drüse sichtbar zu demonstrieren, wurde eine Durchleuchtung mit Radiokontrast durchgeführt. Um eine erfolgreiche Transduktion eines Vektors nachzuweisen, wurde ein Adenovirus-Serotyp 5 (Ad5) vektorisiertes egfp-Gen verwendet. Ad5 ist ein gut beschriebener Vektor, der in der Lage ist, Speichelgewebe zu transduzieren. Obwohl es für den endgültigen klinischen Einsatz zu immunogen ist, wurde für diese Demonstrationsstudie ein Ad5-Vektor ausgewählt, um eine effiziente Transduktion zu gewährleisten. Die Evaluierung der Produktion von Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) ist eine gut beschriebene Methode zum Nachweis der erfolgreichen Transkription und Translation eines vektorisierten Gens nach der Transduktion und wurde hier durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll der retrograden Infusion in die Ohrspeicheldrüse durch Stensens Gang. Die beschriebene Methodik bietet eine Anleitung, die möglicherweise von Forschern verwendet werden kann, die den Nutzen von Speichelgewebe als Ort für Gentherapie und andere Anwendungen untersuchen.
Es gibt mehrere kritische Schritte, um den Erfolg des Verfahrens sicherzustellen. In erster Linie sollten alle Verfahrensschritte schonend abgeschlossen werden. Eine kräftige Versteifung des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Herrn Cagney Gentry für seine audiovisuelle Unterstützung bei den Dreharbeiten. Wir möchten auch das Hefner VA Medical Center für die akademische Unterstützung bei der Verfolgung dieses Projekts anerkennen.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
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