زرع القنية المباشرة في ماجنا سيسترنا من الخنازير
Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لزرع القنية المباشرة في ماجنا cisterna من الخنازير.
Abstract
النظام الجليميفي هو نظام لإزالة النفايات في الدماغ يعتمد على تدفق السائل النخاعي (CSF) في المساحات المحيطة بفترة ما حول الأوعية الدموية المرتبطة بالخلايا الفلكية وقد تورط في إزالة الببتيدات العصبية السمية مثل أميلويد بيتا. يؤدي ضعف وظيفة الجلمفاتيك إلى تفاقم أمراض الأمراض في النماذج الحيوانية للأمراض العصبية التنكسية ، مثل مرض الزهايمر ، مما يسلط الضوء على أهمية فهم نظام التخليص هذا. غالبا ما تتم دراسة النظام الجليمافي بواسطة عبوات cisterna magna (CMc) ، حيث يتم تسليم التتبع مباشرة إلى السائل النخاعي (CSF). ومع ذلك، فقد أجريت معظم الدراسات على القوارض. هنا، ونحن نظهر التكيف من تقنية CMc في الخنازير. باستخدام CMc في الخنازير ، يمكن دراسة النظام الجليمفي بدقة بصرية عالية في الأدمغة الجيرنسيفالية ، وبذلك يسد الفجوة المعرفية بين القوارض والجاذبية البشرية.
Introduction
السائل النخاعي (CSF) هو نسبة فائقة من الدم موجود داخل وحول الجهاز العصبي المركزي (CNS)1,2. وبصرف النظر عن إعطاء الطفو للدماغ أو امتصاص القوى الميكانيكية الضارة، CSF يلعب أيضا دورا محوريا في إزالة النفايات الأيضية من CNS3. يتم تسهيل إزالة النفايات من خلال نظام الجليمافتا الذي تم توصيفه مؤخرا والذي يسمح بالتدفق الحراري ل CSF عبر بارنشيما الدماغ عبر المساحات المحيطة بوعية الدموية (PVS) ، والتي تطوق الشرايين المخترقة3،4،5. وقد تبين أن هذه العملية تعتمد على aquaporin-4 (AQP4)، وهي قناة مائية يتم التعبير عنها في المقام الأول على النهاية الفلكية، المرتبطة ب PVS4,6. وتتحقق دراسة النظام الجليمفاتيكي من خلال التصوير الحي والجسم الحي السابق، باستخدام المجهر الضوئي المتقدم أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، بعد إدخال متتبع فلوري/مشع أو عامل تباين في CSF7,8,9,10,11.
وهناك طريقة فعالة لإدخال التتبع في CSF دون تكبد أضرار في الدماغ parenchyma هو من خلال cisterna ماجنا cannulation (CMc)12,13. وقد أجريت أغلبية كبيرة من جميع الدراسات الجليمفية، حتى الآن في القوارض وتجنبها في الثدييات العليا بسبب الغازية من CMc إلى جانب البساطة العملية للعمل مع الثدييات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الجماجم الرقيقة للفئران بالتصوير الحي دون الحاجة إلى نافذة الجمجمة وتسمح لاحقا باستخراج الدماغ غير المعقد1114. وقد أسفرت التجارب التي أجريت على البشر عن تنظير كبير قيم في بيانات الجسم الحي على وظيفة الجليمافيتيك، ولكنها اعتمدت على حقن التتبع داخل اللثة في العمود الفقري القطني البعيدة، وعلاوة على ذلك، الاستفادة من التصوير بالرنين المغناطيسي الذي لا يسفر عن دقة كافية لالتقاط استئصال الدقيقة النظام الجليمافي7،15،16 . فهم الهندسة المعمارية ومدى النظام الجلمفي في الثدييات العليا أمر ضروري لترجمته إلى البشر. من أجل تسهيل الترجمة الجليمفاتيكية للبشر ، من المهم تطبيق التقنيات التي يتم تنفيذها في القوارض على الثدييات العليا من أجل السماح بإجراء مقارنات مباشرة للنظام الجليمفي عبر أنواع من الإدراك المتزايد وتعقيد الدماغ17. الخنازير والأدمغة البشرية هي جيرونسيفال، وامتلاك neuroarchitecture مطوية، في حين أن أدمغة القوارض هي lissencephalic، وبالتالي وجود فرق كبير بين بعضها البعض. من حيث الحجم الإجمالي ، فإن أدمغة الخنازير هي أيضا أكثر قابلية للمقارنة مع البشر ، كونها أصغر 10-15 مرة من الدماغ البشري ، في حين أن أدمغة الفئران أصغر 3000 مرة18. من خلال فهم أفضل للنظام الجليمفاتيكي في الثدييات الكبيرة ، قد يكون من الممكن استخدام نظام الجليمفاتيك البشري للتدخل العلاجي في المستقبل في ظروف مثل السكتة الدماغية وإصابات الدماغ الرضية والتنكس العصبي. CMc المباشر في الخنازير في الجسم الحي هو الأسلوب الذي يسمح للفحص المجهري الخفيف عالي الدقة للنظام الجلمفي في الثدييات العليا. وعلاوة على ذلك، ونظرا لحجم الخنازير المستخدمة، فمن الممكن تطبيق أنظمة رصد مماثلة لتلك المستخدمة في العمليات الجراحية البشرية مما يجعل من الممكن لتوثيق وتنظيم الوظائف الحيوية بإحكام من أجل تقييم كيفية مساهمة هذه في وظيفة الجليمفاتيك.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يوصف، بروتوكول مفصل لتنفيذ العلبة المباشرة للشهامة cisterna في الخنازير، بما في ذلك الإعداد اللازم، وإجراء العمليات الجراحية، ضخ التتبع واستخراج الدماغ. وهذا يتطلب شخص لديه خبرة وشهادة للعمل مع الحيوانات الكبيرة. إذا نفذت بشكل صحيح، وهذا يسمح لتسليم الجزيئات المطلوبة مع ضمان مباشرة في …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة كنوت وأليس والنبرغ، وهجارفوندن، ومؤسسات وينر غرين، ومؤسسة كرافورد.
Materials
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
References
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M. Garbage truck of the brain. Science. 340 (6140), 1529-1530 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic function in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2021).
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D’Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
