Multiparametre Optofluidik Platform Kullanılarak Kalsiyum Akını ve HIV-1 Enfeksiyonunun Tek Hücreli Karakterizasyonu
Summary
Burada, nanoakışkan bir cihazda akut olaylar ve üretken HIV-1 enfeksiyonu için tek hücrelerin izlendiği bir protokol sunuyoruz. Görüntüleme verileri virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlar. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntülemenin sinyal kinetik ve moleküler etkileşimleri incelemek için ilk yöntemidir.
Abstract
HIV-1, dünya çapında 37 milyondan fazla insanı etkileyen kronik bir enfeksiyona neden olur. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile yaşayan insanlar antiretroviral tedaviye rağmen kronik inflamasyona bağlı komorbidiite yaşarlar. Bununla birlikte, bu enflamatuar sinyalizasyon tam olarak karakterize edilmiştir. Hücresel sinyal olaylarının aktivasyonu ve aşağı akış gen ekspresyasyonunda erken giriş olaylarının rolü tek hücre düzeyinde yakalanmamıştır. Burada yazarlar, canlı hücre floresan mikroskopisi ilkelerini, hücreleri kullanıcı tarafından özelleştirilmiş zaman kursları üzerinden kültürleyen ve dinamik hücresel süreçlerin yüksek verimli analizine izin veren otomatik bir tek hücreli platforma uygulayan bir yöntemi açıklar. Bu test, HIV-1 enfeksiyonunu hemen takip eden erken olayların tek hücreli canlı floresan mikroskopisini, özellikle virüse maruz kalmaya eşlik eden kalsiyum akınını ve floresan bir muhabir virüsü kullanarak üretken enfeksiyonun gelişmesini izleyebilir. MT-4 hücreleri kalsiyuma duyarlı bir boya ile yüklenir ve nanoakışkan bir cihazda izole kalemlerde kültürlenir. Kültürlü hücrelere HIV-1 muhabir virüsü (HIV-1 NLCI) bulaşır. Nanoakışkan cihazın üzerine yerleştirilmiş bir floresan mikroskobu, akut HIV-1 maruziyetini takiben 8 dakikalık bir zaman diliminde kalsiyum akınını ölçer. HIV-1 üretken enfeksiyonu aynı hücrelerde 4 günlük aralıklarla ölçülür. Bu zaman derslerinden elde edilen görüntüleme verileri, virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlamak için analiz edilir. Yazarlar, tek hücreli sıralama, kültleştirme, görüntüleme ve yazılım otomasyonu yapabilen yeni bir optofluidik platform kullanarak geleneksel görüntüleme yöntemlerine entegre, ölçeklenebilir bir alternatif sunarlar. Bu tahlil, bir dizi parametreyi ölçerken hücre tipi, agonist veya antagonist etki de dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında olayların kinetiğini ölçebilir. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntüleme için ilk kurulan yöntemdir: Bu teknik, hücresel sinyal kinetiği ve dinamik moleküler etkileşimleri incelemek için geniş ölçüde uyarlanabilir.
Introduction
Kronik inflamasyon HIV ile ilişkili erken morbiditelerin ve mortalitenin önde gelen bir nedenidir1,2,3. HIV’in enflamatuar sinyali aktive edebildiği birden fazla mekanizma vardır ve son kanıtlar, HIV girişinde kalsiyum-gating adenozin trifosfat (ATP) reseptörleri 3 , 4 , 5 , 6,7 ,8,9,10olan P2X reseptörleri için bir rol olduğunu göstermektedir. Pürinerjik reseptörlerin (P2XR) P2X alt tipi bu iltihabın önemli kolaylaştırıcıları olabilir. Bununla birlikte, HIV-P2XR etkileşimlerinin moleküler mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir ve erken ve geç HIV-1 viral yaşam döngüsü adımlarını etkileyebilir. HIV ile ilişkili kronik inflamasyonu yönlendiren yolların ve kinetiklerin tanımlanması, HIV’li insanlar için tedavi seçeneklerinin ilerlemesi için kritik öneme sahiptir.
HIV-1’in P2X reseptörlerini doğrudan acıtırıp acıtmadığını değerlendirmek için P2XR aktivasyonu ve HIV-1 enfeksiyonu paralel olarak ölçülmelidir. P2XR aktivitesi ve HIV-1 enfeksiyonu tahlilleri bağımsız olarak belirlenmiştir: Hücresel kalsiyum akını P2XR aktivasyonunun bir göstergesidir ve HIV-1 üretken enfeksiyonu RNA bolluğu ile ölçülebilir. Fluo-4 kalsiyuma duyarlı boya ile kalsiyum akınının floresan tespiti mümkündür ve HIV-1 enfeksiyonu mCherry floresan muhabir virüsü HIV-NLCI11 , 12,13,14,15ile görselleştirilebilir.
P2X aktivasyonu (akut hücresel kalsiyum akını) ve HIV-1 enfeksiyonu (HIV-1 RNA sentezi) bu göstergeleri farklı zaman ölçeklerinde (dakikalara karşı günler) ortaya çıktığı için, P2XR aktivasyonu ve HIV-1 enfeksiyonunun eşleştirilmiş analizine izin veren yüksek verimli bir yöntem yoktur. Akış sitometrisi gibi standart yüksek verimli deneysel teknikler popülasyon analizine izin verir, ancak tek hücrelerde akut ve boyuna olaylar arasındaki ilişkiyi değerlendiremez. Alternatif olarak, standart floresan mikroskopi ile tek hücreli görüntüleme düşük verimdir. Bu deneysel sınırlamalar, akut ve boyuna hücresel olaylar arasındaki ilişkileri doğrudan ölçmek için yeni, yüksek verimli tekniklere ihtiyaç duymaktadır.
Açıklanan optofluidik sistem, tek hücreli sıralama ve izolasyon, kültleştirme, görüntüleme ve yazılım otomasyonu16 , 17,18,19. Bu sistem, geleneksel görüntüleme yöntemlerinin sınırlamalarına entegre, yüksek verimli bir alternatif sunar. Beacon platformu, bir çipin içerdiği hücreleri destekleyen bir karbondioksit (CO2)ve sıcaklık kontrollü inkübatörden oluşur. Çip, hedeflenen ışığa yanıt olarak elektriksel bir gradyan üreten ışığa duyarlı transistörlere sahiptir. Elde edilen bu dielektrofotik kuvvet, nanoakışkan çip boyunca tek tek hücreleri istenen bölgelere taşımak için kullanılır. Hücreler, tek tek hücreleri fiziksel olarak izole etmek için bir bariyer sağlayan çip üzerindeki kalemlere sıralanır. Çip boyunca sürekli laminer büyüme ortamı akışı, kalemlerden hücre göçlerini önlerken, besin maddelerinin ve deneye özgü reaktiflerin küçük parçacıklı difüzyonunu sağlar. Bir floresan mikroskobu çipin üzerinde bulunur. Yazılım otomasyonu, çipin görüntülerini kullanıcı tarafından belirtilen zaman noktasında yakalamak için kullanılır.
Tüm hücre karakterizasyonu, tek hücreli seçim ve manipülasyon için optofluidik bir sistem kullanılarak gerçekleştirildi. Bu sistem, tek hücreli manipülasyon, tahlil, kültür ve görüntüleme sağlayan entegre mekanik, mikroakışkan ve optik bileşenlerden oluşur. Hücreler, her biri alt nanoliter hacmini tutabilen 3.500 ayrı odadan (kalem) oluşan tek kullanımlık nanoakışkan cihaza yüklenir ve kültürlenir. Hücreler, hafif kaynaklı dielektrofoetik “kafesler” kullanılarak kalemlere yerleştirilecek ve sıcaklık ve CO2kontrollü koşullar altında kültürlenebilir. Mikroakışkanlar, hücre kültürü veya ilaç tedavisi için çip üzerindeki medya veya tamponların perfüzyonunu izin eder. Aktüasyonlu bir iğne, inkübe ve kepenkli kuyu plakalarından hücrelerin ithal ve ihracatına izin verir. Çip alanı, hücresel fenotipleri veya fonksiyonel analizi karakterize etmek için parlak alan ve floresan kanallarda (DAPI, FITC, TRed veya Cy5 dahil) 4x veya 10x büyütmede görüntülenebilir. Tüm sistem, önceden tasarlanmış iş akışları veya özel denemeler için kullanılabilecek yazılım kullanılarak otomatikleştirilmiştir.
HIV-1 enfeksiyonu ve P2XR arasındaki ilişkiler incelenmiştir, ancak bu etkileşimleri paralel olarak doğrudan karakterize etmek için yüksek verimli bir prosedür bildirilmemiştir. Burada yazarlar, akut kalsiyum akınını ve ardından hiv-1 üretken enfeksiyonunu tek hücre düzeyinde izleyerek HIV-P2XR etkileşimlerini incelemek için bir metodolojiyi açıklarlar. Özellikle, bu, tek hücrelerdeki birden fazla hedefin doğrudan, yüksek verimli, uzunlamasına ölçülmesine izin veren yeni bir araç oluşturur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek hücrelerde kalsiyum akını ve HIV-1 üretken enfeksiyonu arasındaki ilişkiyi incelemek için tanımlanan metodoloji, diğer agonistlere veya ilgi çekici antagonistlere yanıt olarak hücre içi kalsiyum kinetiğini incelemek için uyarlanabilir. Hücrelerin görüntüleme için hazırlanması basittir, minimum zaman yoğundur ve reaktifler yaygın olarak kullanılan üreticilerin uygun kitlerinde mevcuttur. Fluo-4 bazlı kalsiyum ölçümü literatürde iyi tanımlanmıştır ve HIV-1 bu platformda çalışmak i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Benjamin Chen ile yaptığımız bilimsel tartışmalar için minnettarız. Bu çalışma K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS ve KB) ve R21AI152833 (THS ve KB) tarafından finanse edildi.
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
