Caracterización Unicelular De La Afluencia De Calcio Y La Infección Por VIH-1 Utilizando Una Plataforma Optofluídica Multiparámetro
Summary
Aquí, presentamos un protocolo en el cual las solas células se supervisan para los eventos agudos y la infección productiva HIV-1 en un dispositivo nanofluidic. Los datos de imágenes definen las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Este es el primer método para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y las imágenes para estudiar la cinética de señalización y las interacciones moleculares.
Abstract
El VIH-1 causa una infección crónica que afecta a más de 37 millones de personas en todo el mundo. Las personas que viven con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) experimentan comorbilidad relacionada con la inflamación crónica a pesar de la terapia antirretroviral. Sin embargo, estas señales inflamatorias no se han caracterizado completamente. El papel de los eventos de entrada temprana en la activación de los eventos de señalización celular y la expresión génica aguas abajo no se ha capturado a nivel unicelular. Aquí los autores describen un método que aplica los principios de la microscopía de fluorescencia de células vivas a una plataforma unicelular automatizada que cultivos e imágenes de células a través de cursos de tiempo personalizados por el usuario, lo que permite el análisis de alto rendimiento de los procesos celulares dinámicos. Este ensayo puede rastrear la microscopía de fluorescencia en vivo unicelular de los eventos tempranos que siguen inmediatamente a la infección por VIH-1, en particular la afluencia de calcio que acompaña a la exposición al virus y el desarrollo de una infección productiva utilizando un virus reportero fluorescente. Las células MT-4 se cargan con un tinte sensible al calcio y se cultivan en plumas aisladas en un dispositivo nanofluídico. Las células cultivadas están infectadas con un virus reportero del VIH-1 (VIH-1 NLCI). Un microscopio de fluorescencia colocado por encima del dispositivo nanofluídico mide la afluencia de calcio durante un curso de tiempo de 8 minutos después de la exposición aguda al VIH-1. La infección productiva por VIH-1 se mide en esas mismas células durante un intervalo de 4 días. Los datos de imágenes de estos cursos de tiempo se analizan para definir las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Los autores presentan una alternativa integrada y escalable a los métodos de imagen tradicionales utilizando una nueva plataforma optofluídica capaz de clasificar, cultivar, obtener imágenes y automatización de software unicelulares. Este ensayo puede medir la cinética de los eventos bajo diversas condiciones, incluyendo el tipo de célula, agonista, o efecto antagonista, mientras que la medición de una serie de parámetros. Este es el primer método establecido para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y la imagen: Esta técnica se puede adaptar ampliamente para estudiar la cinética de señalización celular y las interacciones moleculares dinámicas.
Introduction
La inflamación crónica es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad tempranas asociadas al VIH1,2,3. Hay mecanismos múltiples por los cuales el VIH pueda activar la señalización inflamatoria, y la evidencia reciente sugiere un papel de los receptores P2X en la entrada del VIH que son receptores de trifosfato de adenosina (ATP) de calcio-gating3,4,5,6,7,8,9,10. El subtipo P2X de receptores purinérgicos (P2XR) puede ser facilitadores importantes de esta inflamación. Sin embargo, los mecanismos moleculares de las interacciones VIH-P2XR son en gran parte desconocidos y pueden afectar los pasos tempranos y tardíos del ciclo de vida viral del VIH-1. Definir las vías y la cinética que impulsan la inflamación crónica asociada al VIH es fundamental para avanzar en las opciones de tratamiento para las personas con VIH.
Para evaluar si el VIH-1 agoniza directamente los receptores P2X, la activación de P2XR y la infección por VIH-1 deben medirse en paralelo. Los análisis de la actividad de P2XR y de la infección VIH-1 se han establecido independientemente: La afluencia celular del calcio es un indicador de la activación de P2XR, y la infección productiva VIH-1 se puede cuantificar por abundancia del ARN. La detección de fluorescencia de la afluencia de calcio es posible con el colorante sensible al calcio Fluo-4, y la infección por VIH-1 se puede visualizar con el virus reportero fluorescente mCherry VIH-NLCI11,12,13,14,15.
Debido a que estos indicadores de activación de P2X (afluencia celular aguda de calcio) y la infección por VIH-1 (síntesis de ARN VIH-1) ocurren en diferentes escalas de tiempo (minutos versus días), no hay un método de alto rendimiento que permita el análisis emparejado de la activación de P2XR y la infección por VIH-1. Las técnicas experimentales estándar de alto rendimiento, como la citometría de flujo, permiten el análisis de la población, pero no pueden evaluar la relación entre los eventos agudos y longitudinales en células individuales. Alternativamente, la proyección de imagen unicelular con microscopia estándar de la fluorescencia es de bajo rendimiento. Estas limitaciones experimentales presentan una necesidad de técnicas nuevas, de alto rendimiento para medir las asociaciones entre los eventos celulares agudos y longitudinales directamente.
Un sistema optofluídico descrito es una nueva plataforma capaz de clasificación y aislamiento unicelular, cultivo, imágenes y automatización de software16,17,18,19. Este sistema presenta una alternativa integrada y de alto rendimiento a las limitaciones de los métodos de imagen tradicionales. La plataforma Beacon consiste en una incubadora de dióxido de carbono (CO2)y temperatura controlada que soporta las células contenidas en un chip. El chip posee transistores fotosensibles que generan un gradiente eléctrico en respuesta a la luz dirigida. Esta fuerza dielectroforética resultante se utiliza para mover células individuales a través del chip nanofluídico a las regiones deseadas. Las células se clasifican en bolígrafos en el chip, que proporcionan una barrera para aislar las células individuales físicamente. El flujo laminar continuo de medios de crecimiento a través del chip evita la migración celular de las plumas al tiempo que permite la difusión de partículas pequeñas de nutrientes y reactivos específicos del experimento. Un microscopio de fluorescencia se encuentra por encima del chip. La automatización de software se utiliza para capturar imágenes del chip en el punto de tiempo especificado por el usuario.
Toda la caracterización celular se realizó utilizando un sistema optofluídico para la selección y manipulación unicelular. Este sistema consiste en componentes mecánicos, microfluídicos y ópticos integrados que permiten la manipulación unicelular, el ensayo, el cultivo y la obtención de imágenes. Las células se cargan y cultivan en el dispositivo nanofluídico desechable que consta de 3.500 cámaras individuales (bolígrafos), cada una capaz de contener el volumen sub-nanolitro. Las células pueden colocarse dentro de corrales utilizando “jaulas” dielectroforéticas inducidas por la luz y cultivarse en condiciones controladas por temperatura y CO2. La microfluídica permite la perfusión de medios o tampones en el chip para el cultivo celular o el tratamiento farmacológico. Una aguja accionada permite la importación y exportación de células de placas de pozo incubadas y obturadas. El área del chip se puede tomar imágenes a un aumento de 4x o 10x en canales fluorescentes y de campo brillante (incluidos DAPI, FITC, TRed o Cy5) para caracterizar fenotipos celulares o análisis funcional. Todo el sistema está automatizado mediante software que se puede utilizar para flujos de trabajo prediseñados o experimentos personalizados.
Se han estudiado las relaciones entre la infección por VIH-1 y P2XR, pero no se ha informado de un procedimiento de alto rendimiento para caracterizar directamente estas interacciones en paralelo. Aquí, los autores describen una metodología para estudiar las interacciones VIH-P2XR a través del seguimiento de la afluencia aguda de calcio y la posterior infección productiva por VIH-1 a nivel unicelular. En particular, esto establece una herramienta novedosa que permite la medición directa, de alto rendimiento y longitudinal de múltiples objetivos en celdas individuales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metodología descrita para estudiar la relación entre la afluencia de calcio y la infección productiva por VIH-1 en células individuales puede adaptarse para estudiar la cinética intracelular del calcio en respuesta a otros agonistas o antagonistas de interés. La preparación de las células para la obtención de imágenes es simple, requiere un tiempo mínimo, y los reactivos están disponibles en kits convenientes de fabricantes ampliamente utilizados. La medición de calcio basada en Fluo-4 está bien descrita…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos por las discusiones científicas con el Dr. Benjamin Chen. Este trabajo fue financiado por K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS y KB) y R21AI152833 (THS y KB).
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
