Caracterização unicelular de influxo de cálcio e infecção pelo HIV-1 usando uma plataforma optofluidica multiparmétrica
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo no qual células únicas são monitoradas para eventos agudos e infecção produtiva pelo HIV-1 em um dispositivo nanofluido. Os dados de imagem definem interações entre receptores de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Este é o primeiro método para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade para estudar a cinética e as interações moleculares.
Abstract
O HIV-1 causa uma infecção crônica que afeta mais de 37 milhões de pessoas em todo o mundo. Pessoas vivendo com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) experimentam comorbidade relacionada à inflamação crônica, apesar da terapia antirretroviral. No entanto, essas sinalizações inflamatórias não foram totalmente caracterizadas. O papel dos eventos de entrada precoce na ativação de eventos de sinalização celular e expressão genética a jusante não foi capturado no nível de célula única. Aqui, os autores descrevem um método que aplica princípios da microscopia de fluorescência de células vivas a uma plataforma automatizada de células únicas que culturas e células de imagens ao longo de cursos de tempo personalizados pelo usuário, permitindo a análise de alto rendimento de processos celulares dinâmicos. Este ensaio pode rastrear a microscopia de fluorescência ao vivo unicelular de eventos precoces que seguem imediatamente a infecção pelo HIV-1, notadamente o fluxo de cálcio que acompanha a exposição ao vírus e o desenvolvimento de infecção produtiva usando um vírus repórter fluorescente. As células MT-4 são carregadas com um corante sensível ao cálcio e cultivadas em canetas isoladas em um dispositivo nanofluido. As células cultivadas estão infectadas com um vírus repórter HIV-1 (HIV-1 NLCI). Um microscópio de fluorescência posicionado acima do dispositivo nanofluido mede o fluxo de cálcio ao longo de um curso de tempo de 8 minutos após a exposição aguda ao HIV-1. A infecção produtiva do HIV-1 é medida nessas mesmas células durante um intervalo de 4 dias. Os dados de imagem desses cursos de tempo são analisados para definir interações receptoras de receptores de vírus e dinâmicas de caminhos de sinalização. Os autores apresentam uma alternativa integrada e escalável aos métodos tradicionais de imagem usando uma nova plataforma optofluidic capaz de classificação unicelular, cultivo, imagem e automação de software. Este ensaio pode medir a cinética dos eventos em várias condições, incluindo tipo de célula, efeito agonista ou antagonista, enquanto mede uma série de parâmetros. Este é o primeiro método estabelecido para a cultura e imagem longitudinal de alta produtividade de alta throughput: Esta técnica pode ser amplamente adaptada para estudar cinética de sinalização celular e interações moleculares dinâmicas.
Introduction
A inflamação crônica é uma das principais causas de morbidades precoces associadas ao HIV e mortalidade1,2,3. Existem múltiplos mecanismos pelos quais o HIV pode ativar a sinalização inflamatória, e evidências recentes sugerem um papel para os receptores P2X na entrada do HIV que são receptores de adenosina triptosfato de adenosina (ATP) de cálcio3,4,5,6,7,8,9,10. O subtipo P2X de receptores purinérgicos (P2XR) pode ser importante facilitador desta inflamação. No entanto, os mecanismos moleculares das interações HIV-P2XR são amplamente desconhecidos e podem impactar as etapas do ciclo de vida viral do HIV-1. Definir os caminhos e cinéticas que conduzem a inflamação crônica associada ao HIV é fundamental para o avanço das opções de tratamento para pessoas com HIV.
Para avaliar se o HIV-1 agoniza diretamente os receptores P2X, a ativação P2XR e a infecção pelo HIV-1 devem ser medidos em paralelo. Ensaios da atividade P2XR e infecção pelo HIV-1 foram estabelecidos de forma independente: o fluxo de cálcio celular é um indicador da ativação P2XR, e a infecção produtiva pelo HIV-1 pode ser quantificada pela abundância de RNA. A detecção de fluorescência do fluxo de cálcio é possível com o corante sensível ao cálcio Fluo-4, e a infecção pelo HIV-1 pode ser visualizada com o vírus mCherry fluorescente HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Como esses indicadores de ativação P2X (fluxo de cálcio celular agudo) e infecção pelo HIV-1 (síntese de RNA HIV-1) ocorrem em diferentes escalas de tempo (minutos versus dias), falta um método de alta produtividade que permita a análise emparelhada da ativação P2XR e da infecção pelo HIV-1. Técnicas experimentais padrão de alto rendimento, como a citometria de fluxo, permitem a análise populacional, mas não podem avaliar a relação entre eventos agudos e longitudinais em células únicas. Alternativamente, a imagem unicelular com microscopia de fluorescência padrão é de baixa produtividade. Essas limitações experimentais apresentam a necessidade de novas técnicas de alta produtividade para medir associações entre eventos celulares agudos e longitudinais diretamente.
Um sistema optofluido descrito é uma nova plataforma capaz de triagem e isolamento unicelulares, culminando, imagem e automação de software16,17,18,19. Este sistema apresenta uma alternativa integrada e de alto rendimento às limitações dos métodos tradicionais de imagem. A plataforma Beacon consiste em um dióxido de carbono (CO2) e uma incubadora controlada pela temperatura que suporta células contidas em um chip. O chip possui transistores fotosensíveis que geram um gradiente elétrico em resposta à luz direcionada. Esta força dielectrophoretic resultante é usada para mover células individuais através do chip nanofluido para as regiões desejadas. As células são classificadas em canetas no chip, que fornecem uma barreira para isolar células individuais fisicamente. O fluxo contínuo de mídia de crescimento em todo o chip impede a migração celular das canetas, permitindo a difusão de pequenas partículas de nutrientes e reagentes específicos do experimento. Um microscópio de fluorescência fica acima do chip. A automação de software é usada para capturar imagens do chip no ponto de tempo especificado pelo usuário.
Toda a caracterização celular foi realizada utilizando-se um sistema optofluido para seleção e manipulação de células únicas. Este sistema consiste em componentes mecânicos, microfluidos e ópticos integrados que permitem manipulação de células únicas, ensaio, cultura e imagem. As células são carregadas e cultivadas no dispositivo nanofluido descartável composto por 3.500 câmaras individuais (canetas), cada uma capaz de segurar volume sub-nanolílito. As células podem ser posicionadas dentro de canetas usando “gaiolas” dielectrophoretic induzidas pela luz e cultivadas sob condições controladas por temperatura e CO2. Os microfluidos permitem a perfusão de mídia ou buffers no chip para cultura celular ou tratamento medicamentoso. Uma agulha acionada permite a importação e exportação de células de placas de poços incubadas e fechadas. A área do chip pode ser visualizada em ampliação de 4x ou 10x em canais brightfield e fluorescentes (incluindo DAPI, FITC, TRed ou Cy5) para caracterizar fenótipos celulares ou análise funcional. Todo o sistema é automatizado usando software que pode ser usado para fluxos de trabalho pré-projetados ou experimentos personalizados.
Foram estudadas relações entre a infecção pelo HIV-1 e o P2XR, mas não foi relatado um procedimento de alto rendimento para caracterizar diretamente essas interações em paralelo. Aqui, os autores descrevem uma metodologia para estudar as interações HIV-P2XR através do rastreamento do fluxo agudo de cálcio e da infecção produtiva subsequente do HIV-1 no nível unicelular. Notavelmente, isso estabelece uma nova ferramenta que permite a medição direta, de alto rendimento e longitudinal de múltiplos alvos em células únicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A metodologia descrita para estudar a relação entre o fluxo de cálcio e a infecção produtiva pelo HIV-1 em células únicas pode ser adaptada para estudar cinética de cálcio intracelular em resposta a outros agonistas ou antagonistas de interesse. A preparação de células para imagens é simples, minimamente intensiva em tempo, e os reagentes estão disponíveis em kits convenientes de fabricantes amplamente utilizados. A medição de cálcio à base de fluo-4 é bem descrita na literatura, e o HIV-1 pode ser fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos pelas discussões científicas com o Dr. Benjamin Chen. Este trabalho foi financiado por K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS e KB) e R21AI152833 (THS e KB).
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
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