Caratterizzazione a una cellula dell'afflusso di calcio e dell'infezione da HIV-1 utilizzando una piattaforma optofluidica multiparametro

L’infiammazione cronica è una delle principali cause di morbilità precoce associata all’HIV e^{mortalità 1,2,3}. Esistono diversi meccanismi in base ai quali l’HIV può attivare la segnalazione infiammatoria, e recenti prove suggeriscono un ruolo per i recettori P2X nell’ingresso dell’HIV che sono recettori del trifosfato di adenosina (ATP) che gating^{calcio 3,4,5,6,7,8,9,10}. Il sottotipo P2X dei recettori purinergici (P2XR) può essere importante facilitatore di questa infiammazione. Tuttavia, i meccanismi molecolari delle interazioni HIV-P2XR sono in gran parte sconosciuti e possono avere un impatto sulle fasi del ciclo di vita virale dell’HIV-1 precoce e tardivo. Definire i percorsi e la cinetica che guidano l’infiammazione cronica associata all’HIV è fondamentale per far avanzare le opzioni di trattamento per le persone con HIV.

Per valutare se l’HIV-1 agonizza direttamente i recettori P2X, l’attivazione P2XR e l’infezione da HIV-1 devono essere misurate in parallelo. I test sull’attività P2XR e sull’infezione da HIV-1 sono stati stabiliti in modo indipendente: l’afflusso di calcio cellulare è un indicatore dell’attivazione P2XR e l’infezione produttiva dell’HIV-1 può essere quantificata dall’abbondanza di RNA. Il rilevamento della fluorescenza dell’afflusso di calcio è possibile con il colorante sensibile al calcio Fluo-4 e l’infezione da HIV-1 può essere visualizzato con il virus reporter fluorescente mCherry HIV-NLCI^{11,12,13,14,15}.

Poiché questi indicatori di attivazione P2X (afflusso acuto di calcio cellulare) e infezione da HIV-1 (sintesi dell’RNA HIV-1) si verificano su scale temporali diverse (minuti contro giorni), manca un metodo ad alta produttività che consenta un’analisi accoppiata dell’attivazione P2XR e dell’infezione da HIV-1. Le tecniche sperimentali standard ad alta produttività, come la citometria del flusso, consentono l’analisi della popolazione ma non possono valutare la relazione tra eventi acuti e longitudinali in singole cellule. In alternativa, l’imaging a cella singola con microscopia a fluorescenza standard è a bassa produttività. Questi limiti sperimentali presentano la necessità di nuove tecniche ad alta produttività per misurare direttamente le associazioni tra eventi cellulari acuti e longitudinali.

Un sistema optofluidico descritto è una nuova piattaforma in grado di smistamento e isolamento a cella singola, 15, imaging e automazione software^16,17,18,19. Questo sistema presenta un’alternativa integrata ad alta produttività ai limiti dei metodi di imaging tradizionali. La piattaforma Beacon è costituita da un’anidride carbonica (CO₂₎e un incubatore a temperatura controllata che supporta le cellule contenute in un chip. Il chip possiede transistor fotosensibili che generano un gradiente elettrico in risposta alla luce mirata. Questa forza dielettroforetica risultante è usata per spostare singole cellule attraverso il chip nanofluidico nelle regioni desiderate. Le cellule sono ordinate in penne sul chip, che forniscono una barriera per isolare fisicamente le singole cellule. Il flusso laminare continuo dei mezzi di crescita in tutto il chip impedisce la migrazione cellulare dalle penne, consentendo al contempo la diffusione di piccole particelle di nutrienti e reagenti specifici dell’esperimento. Un microscopio a fluorescenza si trova sopra il chip. L’automazione del software viene utilizzata per acquisire immagini del chip nel punto di tempo specificato dall’utente.

Tutta la caratterizzazione delle celle è stata eseguita utilizzando un sistema optofluidico per la selezione e la manipolazione a cella singola. Questo sistema è costituito da componenti meccanici, microfluidici e ottici integrati che consentono la manipolazione, il dosaggio, la coltura e l’imaging a cella singola. Le cellule vengono caricate e coltivate sul dispositivo nanofluidico usa e getta costituito da 3.500 camere singole (penne), ognuna in grado di contenere volume sub-nanoliter. Le cellule possono essere posizionate all’interno di penne utilizzando “gabbie” dielettroforetiche indotte dalla luce e coltivate in condizioni controllate da temperatura e CO_2. Le microfluidica consentono la perfusione di supporti o tamponi sul chip per la coltura cellulare o il trattamento farmacologico. Un ago azionato consente l’importazione e l’esportazione di cellule da piastre di pozzo incubate e tappate. L’area del chip può essere immagine con ingrandimento 4x o 10x in canali fluorescenti e a campo luminoso (inclusi DAPI, FITC, TRed o Cy5) per caratterizzare fenotipi cellulari o analisi funzionali. L’intero sistema è automatizzato utilizzando software che può essere utilizzato per flussi di lavoro predesignati o esperimenti personalizzati.

Sono state studiate le relazioni tra l’infezione da HIV-1 e la P2XR, ma non è stata riportata una procedura ad alta produttività per caratterizzare direttamente queste interazioni in parallelo. Qui, gli autori descrivono una metodologia per studiare le interazioni HIV-P2XR attraverso il monitoraggio dell’afflusso acuto di calcio e della successiva infezione produttiva dell’HIV-1 a livello di singola cellula. In particolare, questo stabilisce un nuovo strumento che consente la misurazione longitudinale diretta, ad alta produttività e longitudinale di più bersagli in singole celle.