توصيف أحادي الخلية لتدفق الكالسيوم والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 باستخدام منصة متعددة المقاييس Optofluidic
Summary
هنا، نقدم بروتوكولا يتم فيه مراقبة الخلايا المفردة للأحداث الحادة والعدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 على جهاز نانوفلويدي. تحدد بيانات التصوير تفاعلات مستقبلات الفيروس المضيف وديناميكيات مسار الإشارات. هذه هي الطريقة الأولى لثقافة الخلايا الواحدة عالية الإنتاجية النانوية والتصوير لدراسة الحركية الإشارات والتفاعلات الجزيئية.
Abstract
يسبب فيروس نقص المناعة البشرية-1 عدوى مزمنة تصيب أكثر من 37 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. يعاني المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) من الأمراض المرضية المرتبطة بالالتهاب المزمن على الرغم من العلاج المضاد للفيروسات العكوسة. ومع ذلك ، فإن هذه الإشارات الالتهابية لم تكن مميزة تماما. لم يتم التقاط دور أحداث الدخول المبكر على تنشيط أحداث الإشارات الخلوية والتعبير الجيني في المصب على مستوى الخلية الواحدة. هنا يصف المؤلفون طريقة تطبق مبادئ المجهر الفلوري للخلايا الحية على منصة آلية أحادية الخلية تقوم بثقافات وصور الخلايا عبر دورات زمنية مخصصة للمستخدم ، مما يسمح بتحليل عالي الإنتاجية للعمليات الخلوية الديناميكية. ويمكن لهذا المقايسة أن يتتبع المجهر الفلوري الحي أحادي الخلية للأحداث المبكرة التي تعقب مباشرة الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1، ولا سيما تدفق الكالسيوم الذي يصاحب التعرض للفيروس وتطور العدوى المنتجة باستخدام فيروس مراسل فلوري. يتم تحميل خلايا MT-4 بصبغة حساسة للكالسيوم ومثقفة في أقلام معزولة على جهاز نانوفلويديك. الخلايا المثقفة مصابة بفيروس مراسل فيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1 NLCI). يقيس المجهر الفلوري المتمركز فوق الجهاز النانوي تدفق الكالسيوم على مدى 8 دقائق من الدورة الزمنية بعد التعرض الحاد لفيروس نقص المناعة البشرية-1. يتم قياس العدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في تلك الخلايا نفسها على مدى فترة 4 أيام. يتم تحليل بيانات التصوير من هذه الدورات الزمنية لتحديد تفاعلات مستقبلات الفيروس المضيف وديناميكيات مسار الإشارات. يقدم المؤلفون بديلا متكاملا وقابلا للتطوير لطرق التصوير التقليدية باستخدام منصة جديدة ل optofluidic قادرة على فرز الخلايا الواحدة وزراعة الخلايا والتصوير وأتمتة البرامج. يمكن لهذا المقايسة قياس حركية الأحداث في ظل ظروف مختلفة، بما في ذلك نوع الخلية أو ناهضها أو تأثير الخصم، مع قياس مجموعة من المعلمات. هذه هي الطريقة الأولى الراسخة لثقافة الخلايا الواحدة والتصوير عالية الإنتاجية النانوية: يمكن تكييف هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة الحركية الإشارات الخلوية والتفاعلات الجزيئية الديناميكية.
Introduction
الالتهاب المزمن هو السبب الرئيسي للأمراض المبكرة المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية والوفيات1و2و3. هناك آليات متعددة حيث فيروس نقص المناعة البشرية يمكن تنشيط الإشارات الالتهابية، وتشير الأدلة الأخيرة دورا لمستقبلات P2X في دخول فيروس نقص المناعة البشرية التي هي الكالسيوم غاتينج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) مستقبلات3،4،5،6،7،8،9،10. قد يكون النوع الفرعي P2X من مستقبلات الpurinergic (P2XR) ميسرين مهمين لهذا الالتهاب. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية لتفاعلات فيروس نقص المناعة البشرية-P2XR غير معروفة إلى حد كبير وقد تؤثر على خطوات دورة الحياة الفيروسية المبكرة والمتأخرة لفيروس نقص المناعة البشرية-1. إن تحديد المسارات والحركة التي تقود الالتهاب المزمن المرتبط بفيروس نقص المناعة البشرية أمر بالغ الأهمية لتعزيز خيارات العلاج للأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.
لتقييم ما إذا كان فيروس نقص المناعة البشرية-1 يعذب مستقبلات P2X بشكل مباشر، يجب قياس تنشيط P2XR والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 بالتوازي. تم تحديد مقايسات نشاط P2XR والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 بشكل مستقل: تدفق الكالسيوم الخلوي هو مؤشر على تنشيط P2XR ، ويمكن قياس العدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 حسب وفرة الحمض النووي الريبي. الكشف عن الفلورية لتدفق الكالسيوم ممكن مع صبغ فلو-4 الحساسة للكالسيوم، ويمكن تصور عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 مع mCherry الفلورسنت مراسل فيروس HIV-NLCI11،12،13،14،15.
لأن هذه المؤشرات لتنشيط P2X (تدفق الكالسيوم الخلوي الحاد) والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1 RNA synthesis) تحدث على جداول زمنية مختلفة (دقائق مقابل أيام) ، هناك نقص في طريقة عالية الإنتاجية تسمح بالتحليل المقترن لتنشيط P2XR والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1. تسمح التقنيات التجريبية القياسية عالية الإنتاجية، مثل قياس التدفق الخلوي، بتحليل السكان ولكنها لا تستطيع تقييم العلاقة بين الأحداث الحادة والطولية في الخلايا المفردة. بدلا من ذلك، التصوير أحادي الخلية مع المجهر الفلوري القياسي منخفض الإنتاجية. هذه القيود التجريبية تمثل حاجة إلى تقنيات جديدة وعالية الإنتاجية لقياس الارتباطات بين الأحداث الخلوية الحادة والطولية مباشرة.
نظام optofluidic الموصوف هو منصة جديدة قادرة على فرز الخلية الواحدة والعزلة ، والاستزراع ، والتصوير ، وأتمتة البرامج16،17،18،19. يقدم هذا النظام بديلا متكاملا عالي الإنتاجية لقيود طرق التصوير التقليدية. تتكون منصة Beacon من حاضنة ثاني أكسيد الكربون (CO2)والحاضنة التي يتم التحكم في درجة حرارتها والتي تدعم الخلايا الموجودة على رقاقة. تمتلك الشريحة ترانزستورات حساسة للضوء تولد تدرجا كهربائيا استجابة للضوء المستهدف. يتم استخدام هذه القوة العازلة الناتجة لنقل الخلايا الفردية عبر رقاقة النانوفلويديك إلى المناطق المرغوبة. يتم فرز الخلايا إلى أقلام على الشريحة ، والتي توفر حاجزا لعزل الخلايا الفردية جسديا. التدفق المستمر للرقم من وسائل الإعلام النمو في جميع أنحاء رقاقة يمنع هجرة الخلايا من الأقلام مع السماح لنشر الجسيمات الصغيرة من المواد الغذائية والكواشف الخاصة بالتجربة. المجهر الفلوري يجلس فوق الشريحة. يتم استخدام أتمتة البرامج لالتقاط صور الشريحة عند النقطة الزمنية المحددة من قبل المستخدم.
تم إجراء جميع توصيف الخلايا باستخدام نظام optofluidic لاختيار الخلية الواحدة والتلاعب بها. يتكون هذا النظام من مكونات ميكانيكية وميكروبية وبصرية متكاملة تمكن من التلاعب بالخلايا الواحدة، والقياس، والثقافة، والتصوير. يتم تحميل الخلايا وتثقف على جهاز nanofluidic المتاح الذي يتكون من 3500 غرفة فردية (أقلام) ، كل منها قادر على عقد حجم نانولتر الفرعية. يمكن وضع الخلايا داخل الأقلام باستخدام “أقفاص” عازلة ناتجة عن الضوء ومثقفة تحت ظروف التحكم في درجة الحرارة و CO2. تسمح المركبات الدقيقة بتشويش الوسائط أو المخازن المؤقتة على الشريحة لثقافة الخلايا أو العلاج من المخدرات. إبرة المحرك يسمح لاستيراد وتصدير الخلايا من لوحات الآبار المحتضنة والمغلقة. يمكن تصوير منطقة الشريحة عند تكبير 4x أو 10x في قنوات brightfield والفلورسنت (بما في ذلك DAPI أو FITC أو TRed أو Cy5) لتوصيف الأنماط الظاهرية الخلوية أو التحليل الوظيفي. النظام بأكمله مؤتمت باستخدام البرامج التي يمكن استخدامها لسير العمل المصمم مسبقا أو التجارب المخصصة.
وقد درست العلاقات بين عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 وفيروس نقص المناعة البشرية 2XR، ولكن لم يتم الإبلاغ عن إجراء عالي الإنتاجية لتوصيف هذه التفاعلات بشكل مباشر بالتوازي. هنا، يصف المؤلفون منهجية لدراسة التفاعلات بين فيروس نقص المناعة البشرية وP2XR من خلال تتبع التدفق الحاد للكالسيوم والعدوى المنتجة اللاحقة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 على مستوى الخلية الواحدة. وتجدر الإشارة إلى أن هذا يؤسس أداة جديدة تسمح بقياس مباشر وعالي الإنتاجية وطولي لأهداف متعددة في خلايا واحدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تكييف المنهجية الموصوفة لدراسة العلاقة بين تدفق الكالسيوم والعدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في الخلايا المفردة لدراسة الحركية الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لناهضات أخرى أو الخصوم من الفائدة. إعداد الخلايا للتصوير بسيط، والحد الأدنى من الوقت المكثف، والكواشف متوفرة في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للمناقشات العلمية مع الدكتور بنجامين تشين. تم تمويل هذا العمل من قبل K08AI120806 (THS) وR01DA052255 (THS و KB) وR21AI152833 (THS و KB).
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
