Kollajen Bazlı İskeleler Kullanılarak Nöroblastomun Üç Boyutlu İn Vitro Biyomimetik Modeli

1. Deneysel tasarım NOT: Her deney için gereken yapı iskelesi ve hücre sayısı, deneyin ölçeğine bağlı olacaktır ve deney tasarımıyla ilgili bu bölümdeki araçlar kullanılarak hesaplanabilir. Gerekli iskele sayısıHücre biyolojisindeki değişiklikler (örneğin, hücre büyümesi ve metabolizması) için genel deneysel zaman çizelgesini ve değerlendirme aralıklarını belirleyin.NOT: Örneğin, deneysel zaman çerçevesi 14 gündür ve her 7 günde bir hücre büyümesi değerlendirilir. Böylece, deneysel zaman noktaları 1, 7, 14. günlerdir ve toplam 3 zaman noktası verir. Ardından, her bir zaman noktasında uygulanacak deneysel uygulama sayısına karar verin. Değişiklikleri izlemek için her zaman noktasında aynı analizleri tamamlamaya çalışın.NOT: İskelelerde hücre büyümesinin tipik analizleri, hücre canlılığı deneylerini, DNA miktar tayini, histolojik boyama ve görüntülemeyi ve gen ekspresyon analizini içerir. Bunlar bölüm 5’te daha ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Birden fazla aşağı akış uygulaması için aynı iskelenin ne zaman kullanılacağına karar verin, örneğin, uygun bir tahlil kullanarak hücre canlılığı değerlendirmesinden sonra, yapı iskelesini DNA/RNA izolasyonu için yeniden kullanın (5.1.11’de tartışılmıştır). Her uygulama için en az 3 biyolojik kopya bulundurun, örneğin hücre canlılığı ve DNA ölçümü için 3 iskele, histoloji için 3 ve gen ekspresyon analizi için 3 iskele. Bu, zaman noktası başına 9 iskeleye eşit olduğundan, 3 zaman noktası için 27 iskele kullanmayı planlayın. Son olarak, bu sayıyı deneysel parametrelerin veya koşulların sayısıyla çarpın (örneğin, çoklu hücre hatlarının değerlendirilmesi, ilk tohumlama yoğunlukları, iskele bileşimleri).NOT: Bu protokolde, bir hücre hattı için 4 farklı başlangıç tohumlama yoğunluğu değerlendiriliyor ve bu da 108 (27 iskele x 4 koşul) iskele gerektiğiyle sonuçlanıyordu. İnsan hatasını hesaba katmak ve ekstra teminat sağlamak için bu sayıya ~ ekleyin, örneğin 108 iskele gerekiyorsa 120 iskele hazırlayın. Gerekli hücre sayısıNOT: Hücrelerin Gün 0’da silindirik bir iskeleye (çap 6 mm, yükseklik 4 mm) ekilmesi için 20 μL hacimde bir hücre süspansiyonu önerilir. Bu 20 μL hücre süspansiyonu başına hücre sayısı, bölüm 1.1’de hesaplanan deneysel tasarıma göre ayarlanır. Yaygın bir başlangıç tohumlama yoğunluğu, aşağıdaki protokol için örnek olarak kullanılan 20 μL başına 2 ×10 5 hücredir.Deney için gereken toplam hücre miktarını hesaplamak için, 20 μL’de ilk 2 ×10 5 hücreyi gerekli iskele sayısıyla çarpın.NOT: Örneğin, 30 iskelenin 20 μL ile çarpımı toplam 600 μL hacim verir. Her iskele 2 × 10 5 hücre gerektiriyorsa, 600 μL süspansiyon toplam 6 × 10 6 hücre (2 × 105 × 30) içerir ve 600 μL’de 6 ×10 6 hücrelik nihai bir gereksinim verir. Deneysel parametrelerin sayısı, gereken toplam hücre sayısını belirleyecektir. Bu nedenle bu protokol, 10 geleneksel 175cm2 şişeyle aynı sayıda hücreyi işleyebilen çok katmanlı bir hücre kültürü şişesi kullanarak hücre kültürünü ana hatlarıyla belirtir. 2. Kollajen bazlı iskelelerin hazırlanması NOT: Coll-I-nHA ve Coll-I-GAG silindirik iskeleler (çap 6 mm, yükseklik 4 mm) yerleşik yöntemler kullanılarak hazırlanır 15,21,27. Daha önce yayınlanmış yöntemlere17 göre kimyasal olarak çapraz bağlandıktan sonra, iskeleler 1 hafta içinde kullanılmalıdır. İstenilen mekanik özelliklere sahip iskelelerin imalatını takiben, iskelelerin tamamen hidratlandığından ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile iyice yıkandığından emin olun.NOT: Bu genellikle iskelelerin çapraz bağlanmasından sonra ~12 saat sürer ve 4 °C’de 100 mL doku kültürü atık kaplarında, kap başına maksimum 50 iskele ve iskele başına 2 mL PBS ile gerçekleştirilebilir. İskeleleri kullanıma hazır olana kadar PBS’de 4 °C’de saklayın. 3. Nöroblastom hücrelerini çok katmanlı bir hücre kültürü şişesinde çoğaltın NOT: Çok katmanlı şişe için en uygun tohumlama yoğunluğu değişecektir. Bu deneyde kullanılan şişe için, üreticinin talimatlarına göre optimum yoğunluk 1 × 107 hücredir. Çok katmanlı şişeyi tohumlamadan önce, hücreleri uygun bir doku kültürü şişesinde (örneğin, bir T175cm2 doku kültürü şişesi) 1 × 107 hücre veya daha yüksek bir yoğunluğa çoğaltın. Hücreleri çok katmanlı şişeye tohumlamak için (bölüm 3.1), onları -80 birleşene kadar büyütün, hasat edin ve hücre sayımını gerçekleştirmek için 3.2.16-3.2.20 adımlarına bakarak mL başına hücre sayısını sayın. Hücre süspansiyonu sayıldıktan sonra, hemen çok katmanlı şişenin tohumlanmasına geçin. Hücre kültürü çalışması, steriliteyi korumak için laminer akış başlığında yapılmalıdır. Çok katmanlı hücre kültürü şişesinin tohumlanması550 mL tam büyüme ortamını (kullanılan hücre hattına bağlı olarak değişir) ve 100 mL steril PBS’yi 37 ° C’lik bir su banyosunda 20 dakika önceden ısıtın. Hasat edilen hücre süspansiyonunu kullanarak, denklem (1)’i kullanarak 1 × 107 hücrenin optimum tohumlama yoğunluğunu elde etmek için gereken hücre süspansiyonunun gerekli hacmini hesaplayın, burada WANT, çok katmanlı şişeyi tohumlamak için gereken hücre sayısını ifade eder ve HAVE, hücre süspansiyonundaki hücre / mL sayısını ifade eder:(1)Örneğin, Gerekli hücre süspansiyonu hacmini önceden ısıtılmış büyüme ortamının 100 mL’sine ekleyin. Kaputa yeni bir çok katmanlı şişe alın, kapağı çıkarın ve şişeyi 60° açıyla tutun. Hücre süspansiyonunun 100 mL’sinin tamamını boynun açılı tarafından aşağı doğru şişeye yavaşça pipetleyin. Şişeyi kapatın ve hücrelerin katmanlar boyunca eşit olarak dağılmasını sağlamak için yan tarafına yerleştirin. 60°’lik bir açıyla, boynun açılı tarafını yavaşça dökerek veya pipetleyerek çok katmanlı şişeye 400 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin. Boyun dolarsa, şişeyi dik konuma getirin veya şişeyi kapatın ve dökmeye geri dönmeden önce yan yatırın.NOT: Aşırı kabarcık oluşumunu önlemek için yavaşça dökün. Tüm baloncukların yukarı çıkmasına izin vermek için şişeye dik konumda hafifçe vurun ve 10 mL’lik bir pipetle çıkarın. Şişenin boynun alt ipliğine kadar doldurulduğundan emin olun; Bunu başarmak için gerekirse daha fazla ortam ekleyin. Çok katmanlı şişeyi kapatın ve açılı boyun 37 °C, O2 ve nemde aşağı bakacak şekilde inkübe edin. Büyümeyi her 2-3 günde bir izdiham için kontrol edin. Çok katmanlı şişenin alt iki katmanının birleşip birleşmediğini kontrol etmek için, bunları ters çevrilmiş bir mikroskobun 4x objektif merceği altında görüntüleyin.NOT: 1 × 107 nöroblastom hücresi ile tohumlandığında, 10 katmanlı şişenin birleşime dönüşmesi tipik olarak bir hafta sürer – ancak bu, kullanılan hücre hattına bağlı olarak değişebilir. Çok katmanlı şişedeki hücrelerin rutin bakımı550 mL tam büyüme ortamını (kullanılan hücre hattına bağlı olarak değişir), 50-100 mL tripsin ve 300 mL steril PBS’yi 37 °C’lik bir su banyosunda 20 dakika önceden ısıtın. Çok katmanlı şişeyi% 70-80 birleşme açısından kontrol edin. Çok katmanlı şişeyi laminer akış başlığına yerleştirin ve harcanan ortamı dökerek şişeden atın. İlk olarak, şişeyi, ortam hava barajının üzerinden bir atık kabına dökülecek şekilde eğin. Dökerken, ortam şişenin açılı boynundan aşağı akana kadar şişeyi 180° döndürün. Kalan sıvıyı ortadan kaldırmak için şişeyi bu eksen boyunca ileri geri döndürün. Açılı boyundan yavaşça 100 mL önceden ısıtılmış steril PBS ekleyerek hücreleri yıkayın. Şişeyi kapatın, PBS’nin eşit dağılımını sağlamak için yan tarafına yerleştirin ve hücreleri yıkamak için şişeyi ileri geri döndürün. PBS yıkamayı 3.2.3 ile aynı şekilde atın. Yıkama adımlarını tekrarlayın. 50 mL önceden ısıtılmış tripsin 50 mL önceden ısıtılmış steril PBS içinde seyreltin. Çok katmanlı şişeye 100 mL seyreltilmiş tripsin çözeltisi ekleyin, kapak ve tripsinin eşit dağılımını sağlamak için şişeyi yan tarafına yerleştirin. Hücre hattı yüksek derecede yapışırsa, 100 mL seyreltilmemiş tripsin kullanın. Şişeyi 37 °C, O2 ve nemde 2-5 dakika inkübe ederek mikroskop altında hücre ayrılmasını izleyin. Gerekirse, ayırmaya yardımcı olmak için şişeye sıkıca vurun veya bir dakika daha inkübatöre geri koyun. Çok katmanlı şişeyi laminer bir akış başlığına yerleştirin ve tripsini 100 mL büyüme ortamı ile nötralize edin. Şişeyi kapatın, yan yatırın ve tam nötralizasyonu sağlamak için ileri geri sallayın. Nötralize hücre süspansiyonunu 4 x 50 mL konik santrifüj tüplerine dökün.NOT: Tam hücre hasadı gerekiyorsa, çok katmanlı şişeyi tekrar 100 mL steril PBS ile yıkayın ve 2 x 50 mL santrifüj tüplerine dökün. Hücreleri peletlemek için hücre süspansiyonunu 50 mL santrifüj tüplerinde 340 × g’da 3-4 dakika santrifüjleyin. Santrifüj tüplerini laminer akış başlığına geri koyun ve her peletten mümkün olduğunca fazla süpernatanı dikkatlice atın.NOT: Pelet büyük ve nispeten gevşek olacaktır ve bu nedenle kolayca bozulabilir. Her pelete 1-5 mL büyüme ortamı ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. 4 adet yeniden süspanse edilmiş peleti 50 mL’lik bir santrifüj tüpünde bir araya getirin, pipetle iyice karıştırın ve toplam hacmi not edin. Hemositometredeki her bir dış kare 30-100 hücre içerecek şekilde hücre sayımı için hücre süspansiyonunun uygun bir seyreltmesini yapın.NOT: Uygun bir başlangıç seyreltmesi 1:100’dür; bunun için 10 μL hücre süspansiyonunu 15 mL’lik yeni bir konik santrifüj tüpüne pipetleyin ve 990 μL steril PBS ile seyreltin. İyice karıştırmak için karışımı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Sayarken hücre stoğunu içeren 50 mL’lik bir santrifüj tüpünü inkübatöre yerleştirin. Temiz bir hemositometre alarak, Şekil 2’de gösterildiği gibi ızgaranın üzerine temiz bir lamel yerleştirin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 10 μL’sini hemositometre odasına pipetleyin. 10 μL’nin tamamı dağıtılmadan hazne dolarsa, pipetlemeyi durdurun. Hemositometreyi bir ışık mikroskobunun 4x objektifinin altına yerleştirin. Hücreleri görselleştirmek için kaba ve ince odağı ayarlayın. Şekil 2’de vurgulandığı gibi odanın dört dış köşe karesindeki hücre sayısını sayın. Dört sayıyı toplayın ve kare başına ortalama hücre sayısını hesaplamak için 4’e bölün. Şekil 2: Hemositometre kullanarak hücre sayımı. Lamel altındaki hemositometreye on mikrolitre hücre süspansiyonu eklenir. Oda daha sonra bir mikroskobun 4x objektif merceğinin altına yerleştirilir ve ızgaranın dört dış köşesindeki hücre sayısı sayılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ortalama sayıyı seyreltme faktörü (örneğin, 100) ile çarpın ve denklem (2)’yi kullanarak mL başına hücre sayısını elde etmek için bu sayıyı 10.000 ile çarpın. (2) Stok çözeltisindeki toplam hücre sayısını, hücre stoğunun toplam hacmiyle çarparak hesaplayın (örneğin, bir araya getirilen 4 yeniden askıda pelet 20 mL’lik bir çözelti oluşturduysa, hücreleri/mL’yi 20 ile çarpın). Çok katmanlı şişeyi korumak için, 1 × 107 hücreyi şişeye geri tohumlamak için gereken hücre stoğu hacmini hesaplamak için adım 3.1.2’de özetlenen denklemi (1) kullanın ve şişeyi yeniden tohumlamak için 3.1.3-3.1.6 adımlarını gerçekleştirin. İskeleleri tohumlamaya hazırsanız, bir sonraki bölüme geçin. 4. İskelelerde nöroblastom hücrelerini tohumlayın Stok hücresi süspansiyonunu hazırlayınNOT: Bu protokol, her yoğunluk arasında 2’lik bir çarpma faktörü ile dört farklı nöroblastom hücresi tohumlama yoğunluğu oluşturma adımlarını özetleyecektir. Bu nedenle, stok süspansiyonundan üç hücre süspansiyonu daha oluşturmak için bir seri seyreltme kullanılacaktır. Hücre kültürü çalışması, steriliteyi korumak için laminer akış başlığında yapılmalıdır.İlk tohumlama yoğunluğunu veya hücre stoğu süspansiyonunu hazırlamak için çok katmanlı şişedeki (bölüm 3.2.19’da sayılan) toplam hücre sayısından ihtiyaç duyulan hücre hacmini hesaplamak için denklem (3) kullanın.(3)NOT: Örneğin, en yüksek tohumlama yoğunluğu 30 iskele için iskele başına 6 × 10 5 hücre gerekiyorsa ve her bir iskele 20 μL hücre süspansiyonu alıyorsa, stok hücre süspansiyonu toplam 600 μL (20 μL × 30 iskele) hacimde 1,8 × 107 hücre (6 ×10 5 hücre × 30 iskele) gerektirecektir.Bu preparattan seri bir seyreltme yapılacağından, bu sayılar iki katına çıkarılmalıdır, yani toplam 1200 μL hacimde 3.6 ×10 7 hücre. Bunu mL başına hücre cinsinden WANT’a dönüştürmek için; 3.6 × 107’yi 1200 μL’ye bölün ve 1000 μL ile çarpın, mL başına 3 × 107 hücre verin.​ Gerekli hacimde hücre stoğu steril 2 mL veya 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne ekleyin ve büyüme ortamı ile 1200 μL’lik bir nihai hacme getirin. Bu tüpü Yoğunluk 1 olarak etiketleyin (Şekil 3). Birden fazla tohumlama yoğunluğu hücre süspansiyonu oluşturmak için seri seyreltme gerçekleştirin.Adım 4.1.1’de hazırlanan Yoğunluk 1’den , Şekil 3’e göre seri seyreltme yoluyla üç yoğunlukta hücre süspansiyonu daha hazırlayın. Büyüme ortamında her yoğunluğu 2 faktörü ile seyreltin. İlk olarak, üç steril 2 mL veya 15 mL santrifüj tüpüne gerekli son hacim (önceki örnekten 600 μL) büyüme ortamı ekleyin. Yoğunluk 1’in yarısını (600 μL) tüplerden birine aktarın, hücre süspansiyonunu seyreltmek için ortamla iyice karıştırın. Bu tüpü Yoğunluk 2 olarak etiketleyin. Yoğunluk 2’nin yarısını (600 μL) bir sonraki tüpe aktarın, hücre süspansiyonunu seyreltmek için ortamla iyice karıştırın. Bu tüpü Yoğunluk 3 olarak etiketleyin. Yoğunluk 3’ün yarısını (600 μL) bir sonraki tüpe aktarın, hücre süspansiyonunu seyreltmek için ortamla iyice karıştırın. Bu tüpü Yoğunluk 4 olarak etiketleyin. Yoğunluk 4’ten 600 μL’yi atın, böylece dört preparatın da nihai hacmi 600 μL’dir. Negatif kontrol olarak, sadece steril 2 mL’lik bir santrifüj tüpüne 600 μL büyüme ortamı ekleyin. Seri seyreltme işleminin şeması için Şekil 3’e bakın. Şekil 3: 4 farklı iskele tohumlama yoğunluğu için 4 süspansiyon hazırlamak için hücre stoğunun seri seyreltilmesi. (A) Sayılar, iskele başına istenen tohumlama yoğunluğuna uyacak şekilde ayarlanabilir ve (B) yoğunluk başına toplam iskele sayısı ile çarpılabilir ve her iskele 20 μL hücre süspansiyonu alır. Bu örnekte, Yoğunluk 1, 30 yapı iskelesi için 600 μL’de 1,8 × 107 hücreye eşdeğer olan yapı iskelesi başına 6 × 105 hücre gerektirir. Bu sayı, seri seyreltmeyi başlatmak için iki katına çıkarılır, çünkü 600 μL daha sonra bir sonraki tüpte 600 μL büyüme ortamında aktarılır ve seyreltilir. Bu işlem, her biri arasında 2 faktör bulunan 4 hücre süspansiyonu olana kadar devam eder. Sadece bir tüpe 600 μL ortam eklenerek negatif bir kontrol yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. İskelelere hücre süspansiyonları eklemeNOT: İskeleleri (PBS’de saklanır) buzdolabından çıkarın ve hücreleri eklemeden önce oda sıcaklığına (RT) gelmelerini bekleyin.PBS’deki iskeleleri laminer akış başlığına getirin. Steril cımbız kullanarak, iskeleleri, oyuk başına bir iskele olacak şekilde yapışmayan 24 oyuklu plakalara yerleştirin (Şekil 1C). İskeleleri köşelerinden yavaşça kaldırın ve fazla PBS’yi çıkarmak için kabın kenarına hafifçe bastırın. İskeleleri, deri tarafı aşağı bakacak şekilde kuyuların ortasına ekleyin (iskelenin parlak katman tarafı, plastik 24 oyuklu plakalara bakacak şekilde). 24 oyuklu plakaları hücre hattının ayrıntıları, ilgili parametreler (örneğin, tohumlama yoğunluğu) ve zaman noktaları ile etiketleyin. Her seferinde bir hücre tohumlama yoğunluğu ile çalışın, kalan yoğunlukları kullanıma hazır olana kadar 37 ° C’lik inkübatörde tutun. Laminer akış başlığında, her bir iskelenin ortasına 20 μL ilgili hücre süspansiyonunu nazikçe eklemek için bir P20 pipeti ve steril uçlar kullanın (Şekil 1D). Hücreleri iskelelere eklerken iyice karıştırarak hücreleri iyice süspansiyon halinde tutun. Süspansiyonun iskelenin üstünde kaldığından ve kuyu tabanına kaymadığından emin olun, çünkü bu, iskeleye hücre bağlanmasına izin vermeyecektir. Hücreler eklendikten sonra, hücrelerin çoğunun yapışmasına izin vermek için plakaları 3-5 saat (37 °C, O2 ve nem) inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa yavaşça ve nazikçe 1 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin (Şekil 1E). İskelelerin yer değiştirmesini önleyerek daha yavaş ve kontrollü harekete izin vermek için ortamı eklemek için bir P1000 pipet kullanın. Çok fazla sayıda iskele ile çalışıyorsanız, pipet tabancası ‘düşme’ ve ‘düşük’ olarak ayarlanmış 10 mL’lik bir pipet kullanın. 24 oyuklu plakaları gece boyunca inkübe edin (37 °C, O2 ve nem). İskelelerdeki hücrelerin bakımıHücre bağlanmasının ilk 24 saatinden sonra (1. Gün), tohumlanmış iskeleleri yeni yapışmayan 24 oyuklu plakalara aktarın ve 1-2 mL taze büyüme ortamı ekleyin.NOT: Bu adım, iskelelerde büyümelerine izin vermek yerine plastik 24 oyuklu plakaların dibine düşen hücreleri kaldırır. 1. Gün olarak belirlenen iskele kopyaları, bölüm 5’te tartışıldığı gibi 24 saat sonra kaldırılacaktır; Bu nedenle, bu iskeleler için bakım geçerli değildir. Büyüme ortamının renginde bir değişiklik olup olmadığını görmek için başlangıçta her 2-3 günde bir iskeleleri izleyin. Zaman ilerledikçe ve hücreler iskeleler içinde çoğaldıkça, hücreleri daha sık besleyin. 10 mL’lik bir pipet tabancası kullanarak, yavaş modda, harcanan ortamın 1 mL’sini çıkarın ve atın. Şartlandırılmış ortam gerektiren deneyler yapıyorsanız, kullanılmış biyolojik kopya ortamını 15 mL’lik bir santrifüj tüpünde toplayın, hücresel kalıntıları peletlemek için 2 dakika boyunca 340 × g’da santrifüjleyin, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve -80 °C’de saklayın. Pipet üzerindeki damlama işlevini tekrar kullanarak iskelelere yavaşça 2 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin ve 24 oyuklu plakayı inkübatöre geri koyun (37 °C, O2 ve nem). İstenen büyüme periyodu boyunca ortam harcandığında tekrarlayın. 5. İskele alımı ve uygulamaları NOT: Her zaman noktasında, iskelelerde hücre büyümesini izlemek veya gen ve protein ekspresyon profillerini değerlendirmek için çeşitli uygulamalar kullanılabilir. İskele alma koşulları, aşağıdaki alt bölümlerde özetlenen ve Şekil 4’te gösterilen çoklu geri alma yöntemleriyle gerçekleştirilecek analize bağlı olacaktır. İskelelerde hücre canlılığının değerlendirilmesiLaminer akış başlığındaki bir santrifüj tüpüne 0,2 μm’lik bir steril filtreden filtreleyerek uygun hücre canlılığı tahlil reaktifini sterilize edin. Bu steril çözeltiyi, tam büyüme ortamı ve steril PBS ile birlikte 37 °C’lik bir su banyosunda önceden ısıtın. Laminer akış başlığında, analiz edilecek iskeleleri 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarmak için steril cımbız kullanın. Plakayı ilgili tüm ayrıntılarla etiketleyin.NOT: Analizi üç nüsha halinde gerçekleştirin. Her bir oyuğa 900 μL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ve ardından 100 μL steril hücre canlılığı reaktifi ekleyin. İskelesiz bir kuyucuğa 900 μL ortam ve 100 μL steril hücre canlılığı reaktifi ekleyerek negatif bir kontrol ekleyin. Plakanın üzerindeki kapağı değiştirin ve seyreltilmiş hücre canlılığı reaktifini kuyu boyunca eşit olarak dağıtmak için plakayı ~ 3 dakika hafifçe sallayın. Plakayı 37 °C, O2 ve nemde inkübe edin.NOT: İnkübasyon sürelerinin her hücre hattı için optimize edilmesi gerekecektir; Üreticinin yönergelerine bakın. Nöroblastom hücre hatları için 4-6 saatlik inkübasyon optimal görünmektedir. İnkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve birkaç saniye hafifçe sallayın. Laminer akış başlığında yeni, yarı saydam 96 oyuklu bir plaka açın. 24 oyuklu plakadaki her bir oyuktan, inkübe edilmiş ortamı ve reaktifi, kuyu başına 100 μL ile 96 oyuklu plakanın üç oyuğuna aktarın ve teknik üçlüler verin.NOT: Bu transfer, 24 oyuklu plakanın kuyucuklarında 700 μL bırakacaktır. Hücre canlılığı reaktifini ışıktan korumak için 96 oyuklu plakayı alüminyum folyo ile kaplayın. 24 oyuklu plakadaki her bir iskeleden kuyu içeriğinin kalan 700 μL’sini çıkarın ve atın. Her iskeleyi 1 mL steril PBS ile iki kez yıkayın.NOT: İskelelerden tüm renkler kaldırılmayacaktır. Bu iskeleler daha sonra 0.1 M sodyum bikarbonat (NaHCO3) çözeltisi içinde 1 mL %1 Triton X-100 içine yerleştirilerek ve -80 °C’de saklanarak DNA miktar tayini gibi daha ileri uygulamalar için kullanılabilir (bkz. bölüm 5.2, Şekil 4B). 96 oyuklu plakayı laminer akış başlığından çıkarın ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir oyuğun emilimini 570 nm ve 600 nm dalga boylarında ölçün. Absorbans değerlerini her iki dalga boyunda kaydedin ve hücre canlılığı reaktifinin hücreler tarafından yüzde azalmasını hesaplamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Uygun yazılımı kullanarak hücre canlılığı sonuçlarını grafiklendirin ve istatistiksel olarak analiz edin. Hata çubukları üretmek ve tahlil değişkenliğini belirtmek için biyolojik üçlü değerleri girin. Deneysel zaman dilimi boyunca hücre canlılığındaki değişiklikleri incelemek için, uygun biyoistatistiksel yazılımı kullanarak ortalamaların çoklu karşılaştırmaları ile tek yönlü bir varyans analizi (ANOVA) testi gerçekleştirin. Grafiklerdeki zaman noktaları arasındaki anlamlı farkları ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) ve **** (P≤0.0001) olarak belirtin. Şekil 4: Her zaman noktasında farklı analizler için iskelelerin alınması. (A) Hücre canlılığı analizi için üç iskele kopyası alınır. (B) Bu iskeleler daha sonra PBS’de yıkanabilir, 0.1 M NaHCO3’te %1 Triton X-100’e yerleştirilebilir ve DNA miktar tayini için -80 °C’de saklanabilir. (C) Üç kopya daha 15 dakika boyunca% 10 PFA’ya sabitlenir, PBS’de nötralize edilir ve histolojik boyama ve görüntüleme için 4 ° C’de saklanır. (D) Son olarak, fenol/guanidin bazlı bir hücre lizis reaktifine 3 kopya eklenir ve gen ekspresyon analizi için -20 °C’de saklanır. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; PFA = paraformaldehit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. İskelelerdeki hücrelerden DNA’nın miktar tayiniNOT: Adım 5.1.7’den sonraki notta belirtildiği gibi, DNA miktar tayini için iskelelerin alınması, iskelelerin 0,1 M NaHCO3 çözeltisinde 1 mL %1 Triton X-100 içeren 2 mL santrifüj tüplerine yerleştirilmesini ve ardından -80 °C’de depolanmasını içerir. DNA analizi yapılmadan önce, hücrelerin nöroblastom hücrelerini uygun şekilde parçalamak ve miktar tayini için DNA’yı serbest bırakmak için üç donma-çözülme döngüsünden geçmesi gerekir.Daha önce Triton X-100’de saklanan numuneleri -80 °C’den çıkarın. Numuneleri 1-3 saat veya çözülene kadar RT’de bırakın. Numuneleri 10-20 saniye vorteksleyin ve numuneleri 18-24 saat veya tamamen donana kadar -80 °C’de tekrar yerleştirin. Bu işlemi toplam üç donma-çözülme döngüsü için tekrarlayın. DNA verimini en üst düzeye çıkarmak için, iskelelerdeki hücreleri parçalamak için bir doku parçalayıcı kullanın.Triton X-100’de bir iskele içeren 2 mL’lik santrifüj tüpüne metal bir boncuk yerleştirin ve numuneyi 50-2 dakika boyunca 3 salınım/saniyede sallamak için tüpü adaptörün içine yerleştirin.NOT: Metal boncuk konik tabanlı bir tüpe sıkışabileceğinden yuvarlak tabanlı santrifüj tüpleri kullanın. Floresan çift sarmallı DNA (dsDNA) boyası uygulayarak Triton X-100 çözeltisindeki DNA’yı ölçün ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak emisyonu ölçün. Üreticinin yönergelerine bakın; TE tamponunda seri seyreltme yoluyla 8 dsDNA standardı hazırlamak için numuneleri Tris-etilendiamin tetraasetik asit (TE) tamponunda uygun şekilde seyreltin (Şekil 5). Siyah opak 96 oyuklu plakalarda, her bir standarttan veya numuneden 100 μL’yi teknik üçlü olarak kuyucuklara ekleyin. Floresan dsDNA boyasını TE tamponunda 200 kat seyreltin ve çok kanallı bir pipet kullanarak her standart/numuneye 100 μL ekleyin. Plakayı folyo folyo ile kaplayın ve RT’de 5 dakika inkübe edin. Her kuyucuğun floresansını 520 nm’de ölçün ve kaydedin. Her numunedeki DNA konsantrasyonunu hesaplamak için üreticinin yönergelerini izleyin.NOT: Kullanılan hücre hattı için hücre başına ortalama DNA konsantrasyonu biliniyorsa, DNA konsantrasyon değerleri denklem (4) kullanılarak hücre numaralarına dönüştürülebilir.(4) Uygun yazılımı kullanarak DNA niceleme sonuçlarını grafiklendirin ve istatistiksel olarak analiz edin. Hata çubukları üretmek ve tahlil değişkenliğini belirtmek için biyolojik üçlü değerleri girin. Deneysel zaman dilimi boyunca DNA konsantrasyonu / hücre sayısındaki değişiklikleri incelemek için, uygun biyoistatistiksel yazılımı kullanarak araçların çoklu karşılaştırmalarını içeren tek yönlü bir ANOVA testi gerçekleştirin. Grafiklerdeki zaman noktaları arasındaki önemli farkları ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) ve **** (P≤0.0001) olarak belirtin. Şekil 5: Standart bir eğrinin oluşturulması için sekiz DNA standardının hazırlanması. 100 μg/mL’de bir λDNA stok çözeltisi sağlanır. Bu, 2000 ng/mL’de standart A oluşturmak için TE tamponunda 50 kat seyreltilir; 400 μL A daha sonra 400 μL TE tamponu içeren B tüpüne aktarılır; 400 μL B daha sonra aktarılır ve C’de 2 kat seyreltilir ve G’ye kadar devam eder. Standart H sadece TE tamponundan oluşur ve bu nedenle 0 ng / mL’lik bir DNA konsantrasyonuna sahiptir. Kısaltma: TE = Tris-EDTA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Histolojik boyama için iskelelerin hazırlanmasıNOT: İskeleler, immünofloresan (IF) için tam iskeleler olarak veya histolojik boyama veya immünohistokimya (IHC) için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dilimler olarak mikroskopi ve görüntüleme amacıyla sabitlenebilir ve boyanabilir. Bu, yapı iskeleleri içindeki hücre penetrasyonunun ve dağılımının kalitatif değerlendirmesine izin verir ve proteinlerin ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılabilir.PBS’de ‘luk bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın. İskele başına 500 μL’lik bir nihai hacim için yeterli çözelti olduğundan emin olun. Bu çözeltiyi 37 °C’de önceden ısıtın ve iskele alımı için etiketli 2 mL’lik santrifüj tüplerine 500 μL ekleyin. İskeleleri yapışmayan 24 oyuklu plakalardan çıkarın (adım 4.4.4) ve laminer akış başlığına yerleştirin. Steril cımbız kullanarak iskeleleri PFA içeren etiketli santrifüj tüplerine aktarın. İskelelerin PFA çözeltisinde 15 dakika sabitlenmesine izin verin. Her tüpe 500 μL PBS ekleyerek PFA’yı nötralize edin ve 4 °C’de saklayın. İskeleleri Otomatik Temizlik Mendili İşlemcisine hazırlamak için 4 °C’den çıkarın ve cımbız kullanarak ilgili tüm ayrıntıların kurşun kalemle etiketlenmiş plastik kasetlere yerleştirmesini sağlayın. Tüm kasetleri Doku İşlemcisinin metal kabına yerleştirin. İskeleleri sabitlemek, kurutmak, temizlemek ve gece boyunca parafinle sızmak için Doku İşlemcisindeki 12 aşamalı protokole başlayın. İşlenmiş numuneleri içeren kasetleri toplayın. Daha sonra, iskelelerin mikrotomisinin boyama için çok ince dilimler halinde olmasını sağlamak için iskeleleri parafin balmumu bloklarına gömün.NOT: İskeleleri kasetlerden çıkarırken ve balmumuna gömerken, görüntülerin çekildiği açıyı etkileyeceğinden, yönlerini dikkate almak özellikle önemlidir. Bu, yapı iskelelerine hücre sızmasını değerlendirirken önemlidir. Balmumu gömücüyü ve soğuk plakayı açın; Balmumu seviyesini kontrol etmek için kapağı kaldırın. Gerekirse yeniden doldurun. Her seferinde bir örnekle çalışarak kaseti açın, iskeleyi çıkarın ve plastik kalıba ortalayın. Numunenin üzerine sıcak balmumu dökün, doğru yönün korunduğundan emin olun ve balmumu katılaşmadan önce gerekirse ılık cımbızla ayarlayın. Kalıbı doldurmak için daha fazla balmumu dökün. Etiketli kaset kapağını plastik kalıbın üzerine yerleştirin ve üstüne balmumu ekleyin. Balmumu katılaştırmak için kalıbı soğuk tabağa yerleştirin. Parafin mumunun mikrotomiden önce tamamen katılaşmasını sağlamak için gece boyunca 4 °C’de saklayın. Mikrotomiye hazırlanmak için 35 °C’lik bir su banyosunu, kurutma plakasını ve mikrotomu açın. Tutucuya bir bıçak yerleştirin ve sabitlemek için kolu sıkın. İskele bölümleri için genellikle 5 mm olmak üzere trim ve kesit kalınlığını ayarlayın. FFPE iskelesini kalıptan çıkarın, mikrotomun önündeki tutucuya sabitleyin ve bölümleri kesmeden önce numunenin kenarlarındaki fazla mumu dikkatlice kesin. Mikrotomun kolunu döndürerek balmumu bloğunu kesmeye başlayın ve yumuşak hareket sağlayın. Bir seferde yaklaşık 3 iskele bölümü olmak üzere şerit benzeri bölümler toplayın ve kırışıklıkları gidermek için bunları nazikçe 35 °C su banyosuna yerleştirin. Su banyosundayken cımbız kullanarak bölümleri nazikçe ayırın. Polisin kaplı cam mikroskop slaytları kullanarak, her bir bölümü su banyosundan kaldırın, böylece bölüm slaydın ortasına oturur. Her slaydı bir kalemle etiketleyin. Cam slaytları kurutma plakasına veya 60 °C’lik bir kurutma fırınına yerleştirin. Kuruduktan sonra 4 °C’de saklayın ve gerekli histolojik veya IHC boyası ile devam edin. Gen ekspresyon analizi için iskelelerin alınmasıİskeleleri inkübatörden yapışmayan 24 oyuklu plakalardan çıkarın (adım 4.4.4) ve laminer akış başlığına yerleştirin. Steril cımbız kullanarak iskeleleri yeni etiketli 2 mL’lik santrifüj tüplerine aktarın. Bir çeker ocakta, hücreleri iskelelerde parçalamak ve yüksek kaliteli RNA’nın geri kazanılmasına izin vermek için her tüpe 1 mL fenol/guanidin bazlı hücre lizis reaktifi ekleyin. Uygun bir kit kullanarak RNA ekstraksiyonu yapmaya hazır olana kadar tüpleri -20 °C’de saklayın. Standart bir ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR)17 kullanarak, iskelelerdeki hücrelerdeki gen ekspresyonunu değerlendirin.