Трехмерная биомиметическая модель нейробластомы in vitro с использованием скаффолдов на основе коллагена

1. Экспериментальный дизайн ПРИМЕЧАНИЕ: Количество скаффолдов и ячеек, необходимых для каждого эксперимента, будет зависеть от масштаба эксперимента и может быть рассчитано с помощью инструментов, описанных в этом разделе по планированию эксперимента. Необходимое количество строительных лесовОпределите общую временную шкалу экспериментов и интервалы оценки изменений в клеточной биологии (например, клеточного роста и метаболизма).ПРИМЕЧАНИЕ: Например, экспериментальный период составляет 14 дней, с оценкой роста клеток каждые 7 дней. Таким образом, экспериментальными временными точками являются Дни 1, 7, 14, что дает в общей сложности 3 временные точки. Затем определите количество экспериментальных приложений, которые будут применяться в каждый момент времени. Старайтесь выполнять одни и те же анализы в каждый момент времени, чтобы отслеживать изменения.ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный анализ роста клеток на скаффолдах включает анализ жизнеспособности клеток, количественное определение ДНК, гистологическое окрашивание и визуализацию, а также анализ экспрессии генов. Более подробно они будут рассмотрены в разделе 5. Решите, когда использовать один и тот же каркас для нескольких последующих применений, например, после оценки жизнеспособности клетки с помощью соответствующего анализа, повторно использовать каркас для выделения ДНК/РНК (обсуждается в 5.1.11). Храните как минимум 3 биологических репликата для каждого применения, например, 3 скаффолда для жизнеспособности клеток и количественного определения ДНК, 3 для гистологии и 3 для анализа экспрессии генов. Так как это соответствует 9 шаблонам на момент времени, запланируйте использовать 27 скаффолдов для 3 временных точек. Наконец, умножьте это число на количество экспериментальных параметров или условий (например, оценка нескольких клеточных линий, начальной плотности посева, состава каркаса).ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе оценивались 4 различные начальные плотности посева для одной клеточной линии, в результате чего требовалось 108 (27 скаффолдов х 4 условия) скаффолдов. Чтобы учесть человеческий фактор и обеспечить дополнительное покрытие, прибавьте к этому числу ~10%, например, если требуется 108 лесов, подготовьте 120 лесов. Необходимое количество ячеекПРИМЕЧАНИЕ: Для посева клеток на цилиндрический каркас (диаметр 6 мм, высота 4 мм) на день 0 рекомендуется использовать объем клеточной суспензии объемом 20 мкл. Количество клеток на эти 20 мкл клеточной суспензии корректируется в соответствии с планом эксперимента, рассчитанным в разделе 1.1. Общая начальная плотность посева составляет 2 × 10,5 клеток на 20 мкл, что используется в качестве примера для приведенного ниже протокола.Чтобы рассчитать общее количество клеток, необходимых для эксперимента, умножьте исходные 2 ×10,5 клеток на 20 мкл на количество необходимых скаффолдов.ПРИМЕЧАНИЕ: Например, 30 скаффолдов, умноженные на 20 мкл, дают общий объем 600 мкл. Если для каждого каркаса требуется 2 × 10 5 ячеек, то 600 мкл суспензии содержат в общей сложности 6 × 10 6 ячеек (2 × 105 × 30), что дает конечную потребность в 6 × 106 ячеек в 600 мкл. Количество экспериментальных параметров будет диктовать общее количество необходимых ячеек. Таким образом, этот протокол описывает клеточную культуру с использованием многослойной колбы для клеточной культуры, которая может обрабатывать то же количество клеток, что и 10 традиционных колб размером 175см2. 2. Приготовление каркасов на основе коллагена ПРИМЕЧАНИЕ: Цилиндрические скаффолды Coll-I-nHA и Coll-I-GAG (диаметр 6 мм, высота 4 мм) изготавливаются по установленным методам 15,21,27. После химического сшивания в соответствии с ранее опубликованными методами17 скаффолды должны быть использованы в течение 1 недели. После изготовления лесов с требуемыми механическими свойствами убедитесь, что они полностью гидратированы и тщательно промыты в фосфатно-солевом буфере (PBS).ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это занимает ~12 ч после сшивания скаффолдов и может быть выполнено в контейнерах для отходов тканевой культуры объемом 100 мл при 4 °C, с максимальным количеством 50 скаффолдов на контейнер и 2 мл PBS на каркас. Храните каркасы в PBS при температуре 4 °C до использования. 3. Размножение клеток нейробластомы в многослойной колбе для клеточных культур ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность посева для многослойной колбы может варьироваться. Для колбы, используемой в этом эксперименте, оптимальная плотность в соответствии с инструкциями производителя составляет 1 × 107 ячеек. Перед посевом многослойной колбы размножить клетки до плотности 1 × 107 клеток или выше в подходящей колбе для тканевой культуры (например, колбе для тканевой культуры T175см2 ). Чтобы засеять клетки в многослойную колбу (раздел 3.1), вырастить их до слияния 70-80%, собрать и подсчитать количество клеток на мл, обращаясь к шагам 3.2.16-3.2.20 для выполнения подсчета клеток. После того, как клеточная суспензия будет подсчитана, приступают непосредственно к посеву многослойной колбы. Работы с клеточными культурами необходимо проводить в ламинарном колпаке для поддержания стерильности. Посев многослойной колбы для клеточных культурРазогрейте 550 мл полной питательной среды (зависит от используемой клеточной линии) и 100 мл стерильного PBS на водяной бане с температурой 37 °C в течение 20 минут. Используя собранную клеточную суспензию, рассчитайте необходимый объем клеточной суспензии, необходимый для достижения оптимальной плотности посева 1 × 107 клеток, используя уравнение (1), где WANT относится к количеству клеток, необходимых для посева многослойной колбы, а HAVE относится к количеству клеток/мл в клеточной суспензии:(1)например. Добавьте необходимый объем клеточной суспензии к 100 мл предварительно подогретой питательной среды. Возьмите новую многослойную колбу в колпачок, снимите крышку и держите колбу под углом 60°. Медленно пипеткой влейте все 100 мл клеточной суспензии в колбу вниз по скошенной стороне горлышка. Закройте колбу крышкой и положите ее на бок, чтобы ячейки равномерно распределились по слоям. Под углом 60° добавьте 400 мл предварительно подогретой питательной среды в многослойную колбу, медленно вливая или пипетируя вниз по наклонной стороне горлышка. Если горлышко заполнится, верните колбу в вертикальное положение или закройте колбу крышкой и положите ее на бок, прежде чем вернуться к заливке.ПРИМЕЧАНИЕ: Наливайте медленно, чтобы избежать чрезмерного образования пузырьков. Осторожно постучите по колбе в вертикальном положении, чтобы все пузырьки поднялись наверх, и удалите их пипеткой объемом 10 мл. Убедитесь, что колба заполнена до нижней нити горлышка; Для этого добавьте еще медиума, если это необходимо. Закройте многослойную колбу крышкой и инкубируйте ее с наклонным горлышком вниз при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%. Проверяйте рост каждые 2-3 дня на предмет слияния. Чтобы проверить слияние двух нижних слоев многослойной колбы, рассмотрите их под 4-кратным объективом инвертированного микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: При посеве 1 × 107 клеток нейробластомы 10-слойной колбе обычно требуется одна неделя, чтобы слиться, хотя это может варьироваться в зависимости от используемой клеточной линии. Регламентное обслуживание ячеек в многослойной колбеРазогрейте 550 мл полной питательной среды (варьируется в зависимости от используемой клеточной линии), 50-100 мл трипсина и 300 мл стерильного PBS на водяной бане с температурой 37 °C в течение 20 минут. Проверьте многослойную колбу на 70-80% слияние. Поместите многослойную колбу в ламинарный колпак и выбросьте отработанную среду из колбы путем заливки. Первоначально наклоните колбу так, чтобы среда выливалась через воздушную заслонку в контейнер для отходов. Во время заливки поворачивайте колбу на 180° до тех пор, пока среда не будет стекать по наклонному горлышку колбы. Вращайте колбу вперед и назад вдоль этой оси, чтобы удалить оставшуюся жидкость. Промойте клетки, медленно добавляя 100 мл предварительно подогретого стерильного PBS вниз по наклонному горлышку. Закройте колбу крышкой, положите ее на бок, чтобы обеспечить равномерное распределение PBS, и поворачивайте колбу вперед и назад, чтобы промыть клетки. Утилизируйте промывку PBS таким же образом, как и в пункте 3.2.3. Повторите этапы стирки. Разведите 50 мл предварительно подогретого трипсина в 50 мл предварительно подогретого стерильного PBS. Добавьте 100 мл разбавленного раствора трипсина в многослойную колбу, крышку и положите колбу на бок, чтобы обеспечить равномерное распределение трипсина. Если клеточная линия обладает высокой адгезией, используйте 100 мл неразбавленного трипсина. Инкубируют колбу в течение 2-5 мин при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%, контролируя отслоение клеток под микроскопом. При необходимости сильно постучите по колбе, чтобы облегчить отсоединение, или поместите ее обратно в инкубатор еще на одну минуту. Поместите многослойную колбу в ламинарный колпак и нейтрализуйте трипсин 100 мл питательной среды. Закройте колбу, положите ее на бок и покачайте вперед и назад, чтобы обеспечить полную нейтрализацию. Вылейте нейтрализованную клеточную суспензию в 4 конические центрифужные пробирки по 50 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется полный сбор клеток, снова промойте многослойную колбу 100 мл стерильного PBS и перелейте ее в 2 центрифужные пробирки по 50 мл. Центрифужируют клеточную суспензию в центрифужных пробирках объемом 50 мл при 340 × г в течение 3-4 мин до гранулирования клеток. Верните центрифужные пробирки в ламинарный колпак и осторожно удалите как можно больше надосадочной жидкости из каждой гранулы.ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула будет большой и относительно рыхлой, и, следовательно, ее можно легко сломать. Добавьте 1-5 мл питательной среды к каждой грануле и ресуспендируйте ее, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Смешайте 4 ресуспендированные гранулы в одной центрифужной пробирке объемом 50 мл, тщательно перемешайте их пипеткой и запишите общий объем. Сделайте соответствующее разведение клеточной суспензии для подсчета клеток так, чтобы каждый внешний квадрат на гемоцитометре содержал 30-100 клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящее начальное разбавление составляет 1:100; для этого пипетку 10 мкл клеточной суспензии помещают в свежую коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и разбавляют ее 990 мкл стерильного PBS. Пипеткой проведите смесь вверх и вниз несколько раз, чтобы тщательно перемешать. Поместите центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую запас клеток, в инкубатор во время подсчета. Взяв чистый гемоцитометр, положите на сетку чистый покровный листок, как показано на рисунке 2. Пипетку 10 мкл разведенной клеточной суспензии в камеру гемоцитометра. Если камера заполнится до того, как будут выданы все 10 мкл, прекратите пипетирование. Поместите гемоцитометр под 4-кратный объектив светового микроскопа. Отрегулируйте грубый и точный фокус, чтобы визуализировать ячейки. Подсчитайте количество ячеек в четырех внешних угловых квадратах камеры, как показано на рисунке 2. Сложите четыре числа и разделите на 4, чтобы вычислить среднее количество клеток на квадрат. Рисунок 2: Подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Десять микролитров клеточной суспензии добавляют в гемоцитометр под покровным стеклом. Затем камера помещается под 4-кратный объектив микроскопа, и подсчитывается количество ячеек в четырех внешних углах сетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Умножьте среднее количество на коэффициент разведения (например, 100) и умножьте это число на 10 000, чтобы получить количество клеток на мл с помощью уравнения (2). (2) См. Рассчитайте общее количество клеток в исходном растворе, умножив его на общий объем запаса клеток (например, если 4 ресуспендированные гранулы вместе составили 20 мл раствора, умножьте количество клеток/мл на 20). Для поддержания многослойной колбы используйте уравнение (1), описанное на шаге 3.1.2, для расчета объема запаса клеток, необходимого для посева 1 × 107 клеток обратно в колбу, и выполните шаги 3.1.3-3.1.6 для повторного посева колбы. Если вы готовы засеять леса, переходите к следующему разделу. 4. Посев клеток нейробластомы на скаффолды Приготовьте суспензию ячеистой суспензииПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе будут описаны шаги по созданию четырех различных плотностей посева клеток нейробластомы с коэффициентом умножения 2 между каждой плотностью. Таким образом, серийное разведение будет использоваться для создания еще трех клеточных суспензий из исходной суспензии. Работы с клеточными культурами необходимо проводить в ламинарном колпаке для поддержания стерильности.Используйте уравнение (3) для вычисления объема клеток, необходимого из общего числа ячеек в многослойной колбе (подсчитанных в разделе 3.2.19) для приготовления первой плотности посева или суспензии клеточного запаса.(3) См.ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если максимальная плотность посева составляет 6 × 10 5 ячеек на каркас, необходимых для 30 каркасов, при этом каждый каркас получает 20 мкл суспензии ячеек, то для суспензии ячеек стока потребуется 1,8 × 107 ячеек (6 × 105 ячеек × 30 каркасов) общим объемом 600 мкл (20 мкл × 30 каркасов).По мере того, как будет производиться серийное разведение из этого препарата, эти цифры должны быть удвоены, т.е. 3,6 × 107 клеток в общем объеме 1200 мкл. Чтобы преобразовать это значение в WANT в клетках на мл; делим 3,6 ×10 7 на 1200 мкл и умножаем на 1000 мкл, давая 3 × 107 клеток на мл.​ Добавьте необходимый объем клеточного материала в стерильную центрифужную пробирку объемом 2 мл или 15 мл и доведите до конечного объема 1200 мкл с питательной средой. Обозначьте эту трубку как Плотность 1 (Плотность 1) (Рисунок 3). Выполняйте серийное разбавление для создания суспензий ячеек с множественной плотностью засева.Из плотности 1, приготовленной на шаге 4.1.1, приготовьте еще три плотности клеточной суспензии путем последовательного разведения, как показано на рисунке 3. Разбавьте каждую плотность в 2 раза в питательной среде. Сначала добавьте необходимый конечный объем (600 мкл из предыдущего примера) питательной среды в три стерильные центрифужные пробирки объемом 2 мл или 15 мл. Перелейте половину плотности 1 (600 мкл) в одну из пробирок, тщательно перемешав клеточную суспензию со средой для разбавления. Обозначьте эту трубку как Плотность 2. Перелейте половину плотности 2 (600 мкл) в следующую пробирку, тщательно перемешав клеточную суспензию со средой для разбавления. Обозначьте эту трубку как Density 3 (Плотность 3). Перелейте половину плотности 3 (600 мкл) в следующую пробирку, тщательно перемешав клеточную суспензию со средой для разбавления. Обозначьте эту трубку как Density 4 (Плотность 4). Выбросьте 600 мкл из плотности 4 так, чтобы все четыре препарата имели окончательный объем 600 мкл. В качестве отрицательного контроля добавляют 600 мкл питательной среды только в стерильную центрифужную пробирку объемом 2 мл. На рисунке 3 приведена схема процесса последовательного разбавления. Рисунок 3: Серийное разведение клеточного материала для приготовления 4 суспензий для 4 различных плотностей посева строительных лесов. (A) Цифры могут быть скорректированы в соответствии с желаемой плотностью посева на каркас и (B) умножены на общее количество скаффолдов на плотность, при этом каждый каркас получает 20 мкл клеточной суспензии. В этом примере для плотности 1 требуется 6 × 105 ячеек на каркас, что эквивалентно 1,8 × 107 ячеек в 600 мкл для 30 каркасов. Это число удваивается, чтобы начать серийное разведение, так как затем 600 мкл переносится и разводится в 600 мкл питательной среды в следующей пробирке. Этот процесс продолжается до тех пор, пока не останется 4 клеточных суспензии с коэффициентом 2 между каждой. Отрицательный контроль производится путем добавления в пробирку только 600 мкл среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Добавление клеточных суспензий в строительные лесаПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките каркасы (хранящиеся в PBS) из холодильника и дайте им нагреться до комнатной температуры (RT), прежде чем добавлять ячейки.Поместите строительные леса из PBS в зонт ламинарного потока. Используя стерильный пинцет, поместите каркасы в неприклеивающиеся 24-луночные планшеты по одному каркасу на лунку (Рисунок 1C). Осторожно приподнимите леса за углы и слегка прижмите их к стенке контейнера, чтобы удалить излишки PBS. Добавьте строительные леса в центр лунок кожей вниз (блестящий слой леса, обращенный вниз к пластиковым 24-луночным пластинам). Маркируйте 24-луночные планшеты с подробными сведениями о клеточной линии, соответствующих параметрах (например, плотности посева) и временных точках. Работайте с одной плотностью посева клеток за раз, сохраняя оставшуюся плотность в инкубаторе с температурой 37 °C до тех пор, пока она не будет готова к использованию. В ламинарном проточном колпаке с помощью пипетки P20 и стерильных наконечников осторожно добавьте 20 мкл соответствующей клеточной суспензии в центр каждого каркаса (рис. 1D). Тщательно храните клетки во взвешенном состоянии, хорошо перемешивая, добавляя клетки в каркасы. Следите за тем, чтобы подвеска оставалась на верхней части лесов и не соскальзывала на основание колодца, так как это не позволит прикрепить ячейку к лесам. После добавления клеток инкубируйте планшеты в течение 3-5 ч (37 °C, 5%CO2 и влажность 95%), чтобы большая часть клеток прикрепилась. После инкубации медленно и осторожно добавьте в каждую лунку по 1 мл предварительно подогретой питательной среды (рис. 1E). Используйте пипетку P1000 для добавления среды, чтобы обеспечить более медленное и контролируемое движение, предотвращая смещение каркасов. При работе с очень большим количеством каркасов используйте пипетку объемом 10 мл с пистолетом для пипетки, установленным на «падение» и «низкое значение». Инкубируйте 24-луночные планшеты в течение ночи (37 °C, 5%CO2 и 95% влажности). Обслуживание ячеек на строительных лесахПосле первых 24 ч прикрепления клеток (1-й день) переложите засеянные каркасы на новые неприлипшие 24-луночные планшеты и добавьте 1-2 мл свежей питательной среды.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляются клетки, упавшие на дно пластиковых 24-луночных пластин, вместо того, чтобы позволить им расти на каркасах. Реплики лесов, обозначенные как День 1, будут демонтированы через 24 часа, как описано в разделе 5; Следовательно, техническое обслуживание не распространяется на эти леса. Контролируйте каркасы первоначально каждые 2-3 дня на предмет изменения цвета питательной среды. По мере того, как проходит время и клетки размножаются внутри каркасов, кормите клетки чаще. С помощью пистолета для пипетки объемом 10 мл в медленном режиме удалите 1 мл отработанной среды и выбросьте. При проведении экспериментов, требующих кондиционированной среды, отработанную среду биологических репликатов собирают в центрифужную пробирку объемом 15 мл, центрифугируют при 340 × г в течение 2 мин, чтобы гранулировать клеточный мусор, перелейте надосадочную жидкость в свежую пробирку и храните при -80 °C. Осторожно добавьте 2 мл предварительно подогретой питательной среды в каркасы, снова используя функцию капельного орошения на пипетке, и верните 24-луночный планшет в инкубатор (37 °C, 5%CO2 и влажность 95%). Повторяйте каждый раз, когда среда расходуется в течение желаемого периода роста. 5. Извлечение лесов и их применение ПРИМЕЧАНИЕ: В каждый момент времени можно использовать несколько приложений для мониторинга роста клеток на каркасах или оценки профилей экспрессии генов и белков. Условия извлечения скаффолда будут зависеть от выполняемого анализа, при этом несколько методов извлечения описаны в следующих подразделах и продемонстрированы на рисунке 4. Оценка жизнеспособности клеток в каркасахСтерилизуйте соответствующий реагент для анализа жизнеспособности клеток, отфильтровав его через стерильный фильтр 0,2 мкм в центрифужную пробирку в ламинарном колпаке. Предварительно подогрейте этот стерильный раствор вместе с полной питательной средой и стерильным PBS на водяной бане с температурой 37 °C. В ламинарном вытяжном шкафу используйте стерильный пинцет, чтобы перенести каркасы, подлежащие анализу, на свежую 24-луночную пластину. Подпишите табличку со всеми соответствующими деталями.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте анализ в трех экземплярах. Добавьте в каждую лунку 900 мкл предварительно нагретой питательной среды, а затем 100 мкл реагента для обеспечения жизнеспособности стерильных клеток. Включите отрицательный контроль, добавив 900 мкл среды и 100 мкл реагента для определения жизнеспособности стерильных клеток в лунку без каркаса. Установите крышку на планшет и осторожно покачайте планшет в течение ~3 минут, чтобы равномерно распределить разбавленный реагент жизнеспособности клеток по всей лунке. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%.ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации должно быть оптимизировано для каждой клеточной линии; Обратитесь к рекомендациям производителя. Для клеточных линий нейробластомы оптимальным представляется 4-6-часовая инкубация. После инкубации достаньте тарелку из инкубатора и аккуратно покачайте ее в течение нескольких секунд. В ламинарном колпаке откройте новую полупрозрачную 96-луночную пластину. Из каждой лунки в 24-луночном планшете переносят инкубированную среду и реагент в три лунки 96-луночной планшетной пластины по 100 мкл на лунку, получая технические тройки.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот перенос оставит 700 мкл в лунках 24-луночного планшета. Накройте 96-луночную пластину алюминиевой фольгой, чтобы защитить реагент жизнеспособности клеток от света. Удалите и выбросьте оставшиеся 700 мкл содержимого лунки из каждого каркаса в 24-луночном планшете. Вымойте каждый каркас дважды 1 мл стерильного PBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Все цвета не будут удалены со строительных лесов. Затем эти скаффолды можно использовать для дальнейших применений, например, для количественного определения ДНК, поместив их в 1 мл 1% Triton X-100 в 0,1 М растворе бикарбоната натрия (NaHCO3) и храня при -80 °C (см. раздел 5.2, рис. 4B). Извлеките 96-луночный планшет из ламинарного колпака и измерьте поглощение каждой лунки на длинах волн 570 нм и 600 нм с помощью микропланшетного считывателя. Запишите значения поглощения на обеих длинах волн и следуйте инструкциям производителя, чтобы рассчитать процентное снижение жизнеспособности реагента клеток клетками. Стройте графики и статистически анализируйте результаты жизнеспособности клеток с помощью соответствующего программного обеспечения. Введите значения биологических трипликатов, чтобы получить полосы погрешности и указать вариабельность анализа. Чтобы изучить изменения жизнеспособности клеток в течение экспериментального периода, выполните тест одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с многократным сравнением средних значений с использованием соответствующего биостатистического программного обеспечения. Укажите существенные различия между временными точками на графиках как ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) и **** (P≤0,0001). Рисунок 4: Извлечение скаффолдов для различных анализов в каждый момент времени. (A) Для анализа жизнеспособности клеток извлекаются три репликата каркаса. (B) Затем эти скаффолды могут быть промыты в PBS, помещены в 1% Triton X-100 в 0,1 М NaHCO3 и хранятся при -80 °C для количественного определения ДНК. (C) Еще три репликата фиксируют в 10% PFA в течение 15 мин, нейтрализуют в PBS и хранят при 4 °C для гистологического окрашивания и визуализации. (D) Наконец, 3 репликата добавляют к реагенту для лизиса клеток на основе фенола/гуанидина и хранят при -20 °C для анализа экспрессии генов. Сокращения: PBS = фосфатно-солевой буфер; PFA = параформальдегид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Количественное определение ДНК из клеток в скаффолдахПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминалось в примечании после шага 5.1.7, извлечение скаффолдов для количественного определения ДНК включает помещение каркасов в центрифужные пробирки объемом 2 мл, содержащие 1 мл 1% Triton X-100 в 0,1 м растворе NaHCO3 с последующим хранением при -80 °C. Прежде чем можно будет выполнить анализ ДНК, клетки должны пройти три цикла замораживания-оттаивания, чтобы соответствующим образом лизировать клетки нейробластомы и высвободить ДНК для количественного определения.Удалите образцы, ранее хранившиеся в Triton X-100, при температуре -80 °C. Оставьте образцы при RT на 1-3 ч или до оттаивания. Вихрите образцы в течение 10-20 секунд и поместите образцы обратно при -80 °C на 18-24 ч или до полного замерзания. Повторите этот процесс в общей сложности для трех циклов замораживания-оттаивания. Чтобы максимизировать выход ДНК, используйте тканевый лизер для разрушения клеток в каркасах.Поместите металлический шарик в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую каркас в Triton X-100, и поместите пробирку в адаптер, чтобы встряхнуть образец со скоростью 50 колебаний в секунду в течение 2-3 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте центрифужные пробирки с круглым дном, так как металлический валик может застрять в пробирке с коническим дном. Количественно определите ДНК в растворе Triton X-100 путем нанесения флуоресцентного двухцепочечного красителя ДНК (дцДНК) и измерьте излучение с помощью микропланшетного считывателя. Ознакомьтесь с рекомендациями производителя; соответствующим образом разбавить образцы в буфере трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ТЭ) для получения 8 стандартов дцДНК путем последовательного разведения в буфере ТЭ (рисунок 5). В черных непрозрачных 96-луночных планшетах добавляют по 100 мкл каждого стандарта или образца в лунки в техническом трипликате. Разбавьте флуоресцентный краситель дцДНК в 200 раз в TE-буфере и добавьте 100 мкл к каждому стандарту/образцу с помощью многоканальной пипетки. Накройте тарелку фольгой и инкубируйте при RT в течение 5 минут. Измерьте и запишите флуоресценцию каждой лунки с длиной волны 520 нм. Следуйте рекомендациям производителя, чтобы рассчитать концентрацию ДНК в каждом образце.ПРИМЕЧАНИЕ: Если известна средняя концентрация ДНК на клетку для используемой клеточной линии, значения концентрации ДНК могут быть преобразованы в номера клеток с помощью уравнения (4).(4) См. Построение графиков и статистический анализ результатов количественной оценки ДНК с помощью соответствующего программного обеспечения. Введите значения биологических трипликатов, чтобы получить полосы погрешности и указать вариабельность анализа. Чтобы изучить изменения концентрации ДНК/количества клеток в течение экспериментального периода времени, выполните односторонний тест ANOVA с многократным сравнением средних значений с использованием соответствующего биостатистического программного обеспечения. Укажите существенные различия между временными точками на графиках как ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) и **** (P≤0.0001). Рисунок 5: Подготовка восьми стандартов ДНК для генерации стандартной кривой. Исходный раствор λДНК предоставляется в концентрации 100 мкг/мл. Его разбавляют в 50-кратном буфере TE для создания стандартного А в концентрации 2000 нг/мл; Затем 400 мкл А переносят в пробирку В, содержащую 400 мкл ТЭ-буфера; Затем 400 мкл B переносят и разбавляют в 2 раза в C, и так далее до G. Стандарт H состоит только из TE-буфера и, следовательно, имеет концентрацию ДНК 0 нг/мл. Аббревиатура: TE = Tris-EDTA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Подготовка скаффолдов к гистологическому окрашиваниюПРИМЕЧАНИЕ: Скаффолды могут быть зафиксированы и окрашены для целей микроскопии и визуализации либо в виде целых скаффолдов для иммунофлуоресценции (IF), либо в виде фиксированных формалином срезов, залитых парафином (FFPE) для гистологического окрашивания или иммуногистохимии (IHC). Это позволяет качественно оценить проникновение и распределение клеток внутри скаффолдов и может быть использовано для оценки экспрессии белков.Приготовьте 10% раствор параформальдегида (PFA) в PBS. Убедитесь, что раствора достаточно для конечного объема 500 мкл на каркас. Подогрейте этот раствор до 37 °C и добавьте 500 мкл в маркированные центрифужные пробирки объемом 2 мл для извлечения каркаса. Снимите каркасы с неприклеенных 24-луночных пластин (шаг 4.4.4) и поместите их в ламинарный колпак. Стерильным пинцетом перенесите каркасы в центрифужные пробирки с маркировкой, содержащие 10% PFA. Дайте каркасам закрепиться в растворе PFA в течение 15 минут. Нейтрализуйте PFA, добавив 500 мкл PBS в каждую пробирку, и храните при температуре 4 °C. Чтобы подготовить каркасы для автоматического процессора для обработки тканей, извлеките их из температуры 4 °C и с помощью пинцета поместите в пластиковые кассеты со всеми соответствующими деталями карандашом. Поместите все кассеты в металлический контейнер тканевого процессора. Начните 12-этапный протокол на тканях, чтобы зафиксировать, обезвоживать, очищать каркасы и инфильтрировать их парафином на ночь. Соберите кассеты с обработанными образцами. Затем вставьте каркасы в парафиновые восковые блоки, чтобы можно было провести микротомию скаффолдов на очень тонкие ломтики для окрашивания.ПРИМЕЧАНИЕ: Особенно важно учитывать ориентацию скаффолдов при извлечении их из кассет и встраивании в воск, так как это повлияет на угол, под которым будут сделаны изображения. Это важно при оценке проникновения клеток в каркасы. Включите восковой закладчик и холодную пластину; Поднимите крышку, чтобы проверить уровень воска. При необходимости дополните. Работая с одним образцом за раз, откройте кассету, снимите каркас и центрируйте его в пластиковой форме. Налейте горячий воск на образец, убедившись, что поддерживается правильная ориентация, и при необходимости отрегулируйте теплым пинцетом до того, как воск затвердеет. Налейте еще воска, чтобы заполнить форму. Поместите крышку кассеты с этикеткой на пластиковую форму и добавьте сверху воск. Поместите форму на холодную пластину, чтобы воск затвердел. Хранить в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы убедиться, что парафин полностью затвердел перед микротомией. Чтобы подготовиться к микротомии, включите водяную баню с температурой 35 °C, сушильную пластину и микротом. Вставьте лезвие в держатель и затяните рычаг, чтобы зафиксировать его. Установите толщину обрезки и секции, обычно 5 мм для секций лесов. Извлеките каркас FFPE из формы, закрепите его в держателе на передней части микротома и осторожно обрежьте излишки воска по краям образца перед вырезанием секций. Начните врезаться в восковой блок, вращая рычаг микротома, обеспечивая плавное движение. Соберите лентообразные секции, около 3 секций каркаса за раз, и осторожно поместите их на водяную баню с температурой 35 °C, чтобы удалить морщины. Аккуратно отделите секции, находясь на водяной бане, с помощью пинцета. Используя стеклянные предметные стекла для микроскопа с полизиновым покрытием, поднимите каждую секцию из водяной бани так, чтобы она находилась в центре предметного стекла. Подпишите карандашом каждый слайд. Поместите предметные стекла на сушильную плиту или в сушильную печь с температурой 60 °C. После высыхания храните их при температуре 4 °C и приступайте к обязательному гистологическому или ИГХ-окрашиванию. Извлечение скаффолдов для анализа экспрессии геновСнимите каркасы с неприлипших 24-луночных пластин из инкубатора (шаг 4.4.4) и поместите их в ламинарный колпак. С помощью стерильного пинцета перенесите каркасы в центрифужные пробирки объемом 2 мл со свежей этикеткой. В вытяжном шкафу добавьте 1 мл реагента для лизиса клеток на основе фенола/гуанидина в каждую пробирку, чтобы лизировать клетки в каркасах и обеспечить извлечение высококачественной РНК. Храните пробирки при температуре -20 °C до тех пор, пока не будете готовы к экстракции РНК с помощью соответствующего набора. Используя стандартную количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР)17, оценивают экспрессию генов в клетках скаффолдов.