Modelo Biomimético Tridimensional In Vitro de Neuroblastoma Utilizando Arcabouços à Base de Colágeno

1. Delineamento experimental NOTA: O número de scaffolds e células necessários para cada experimento será dependente da escala do experimento e pode ser calculado usando as ferramentas nesta seção sobre planejamento experimental. Número de andaimes necessáriosDeterminar o cronograma experimental geral e os intervalos de avaliação para mudanças na biologia celular (por exemplo, crescimento e metabolismo celular).NOTA: Por exemplo, o período experimental é de 14 dias, com uma avaliação do crescimento celular a cada 7 dias. Assim, os pontos de tempo experimentais são Dias 1, 7, 14 dando um total de 3 pontos de tempo. Em seguida, decida o número de aplicações experimentais a serem aplicadas em cada momento. Tente concluir as mesmas análises em todos os momentos para monitorar as mudanças.NOTA: Análises típicas de crescimento celular em scaffolds incluem ensaios de viabilidade celular, quantificação de DNA, coloração histológica e imagem, e análise de expressão gênica. Estas questões serão discutidas mais aprofundadamente na secção 5. Decidir quando utilizar o mesmo arcabouço para múltiplas aplicações a jusante, por exemplo, após a avaliação da viabilidade celular utilizando um ensaio adequado, reutilizar o arcabouço para isolamento de ADN/ARN (discutido em 5.1.11). Manter um mínimo de 3 réplicas biológicas para cada aplicação, por exemplo, 3 scaffolds para viabilidade celular e quantificação de DNA, 3 para histologia e 3 para análise de expressão gênica. Como isso equivale a 9 andaimes por ponto de tempo, planeje usar 27 andaimes para 3 pontos de tempo. Finalmente, multiplique esse número pelo número de parâmetros ou condições experimentais (por exemplo, avaliação de múltiplas linhagens celulares, densidades iniciais de semeadura, composições de andaimes).NOTA: Neste protocolo, 4 diferentes densidades iniciais de semeadura estavam sendo avaliadas para uma linhagem celular, resultando em 108 (27 scaffolds x 4 condições) scaffolds necessários. Para contabilizar o erro humano e dar cobertura extra, adicione ~10% a esse número, por exemplo, se forem necessários 108 andaimes, prepare 120 andaimes. Número de células necessáriasNOTA: Um volume de 20 μL de suspensão celular é recomendado para semear células em um andaime cilíndrico (diâmetro 6 mm, altura 4 mm) no Dia 0. O número de células por este 20 μL de suspensão celular é ajustado de acordo com o desenho experimental, calculado no ponto 1.1. Uma densidade de semeadura inicial comum é de 2 × 105 células por 20 μL, usada como exemplo para o protocolo abaixo.Para calcular a quantidade total de células necessárias para o experimento, multiplique as 2 × 105 células iniciais por 20 μL pelo número de arcabouços necessários.NOTA: Por exemplo, 30 andaimes multiplicados por 20 μL dá um volume total de 600 μL. Se cada arcabouço requer 2 × 10 5 células, 600 μL de suspensão contém um total de 6 × 10 6 células (2 × 105 × 30), dando uma exigência final de 6 × 106 células em 600 μL. O número de parâmetros experimentais ditará o número total de células necessárias. Este protocolo, portanto, delineia a cultura celular usando um frasco de cultura de células multicamadas, que pode lidar com o mesmo número de células que 10 frascos tradicionais de 175 cm2. 2. Preparação de suportes à base de colágeno OBS: Os scaffolds cilíndricos Coll-I-nHA e Coll-I-GAG (diâmetro 6 mm, altura 4 mm) são preparados usando métodos estabelecidos 15,21,27. Uma vez reticulados quimicamente, de acordo com métodos publicados anteriormente17, os andaimes devem ser usados dentro de 1 semana. Após a fabricação dos andaimes com as propriedades mecânicas desejadas, certifique-se de que os andaimes estejam totalmente hidratados e completamente lavados em solução salina tamponada com fosfato (PBS).NOTA: Isso geralmente leva ~12 h após a reticulação dos scaffolds e pode ser realizado em recipientes de resíduos de cultura de tecidos de 100 mL a 4 °C, com um máximo de 50 scaffolds por recipiente e 2 mL de PBS por scaffold. Conservar os andaimes em PBS a 4 °C até estarem prontos a utilizar. 3. Propagar células de neuroblastoma em frasco de cultura celular multicamadas NOTA: A densidade de semeadura ideal para o frasco multicamadas varia. Para o frasco utilizado neste experimento, a densidade ideal de acordo com as instruções do fabricante é de 1 × 107 células. Antes de semear o balão multicamadas, propagar as células a uma densidade de 1 × 107 células ou superior num balão de cultura de tecidos adequado (por exemplo, um balão de cultura de tecidos T175 cm2 ). Para semear células no frasco multicamadas (secção 3.1), cultivá-las até 70-80% confluentes, colher e contar o número de células por ml, referindo-se aos passos 3.2.16-3.2.20 para a realização da contagem celular. Uma vez contada a suspensão celular, proceder-se imediatamente à semeadura do balão multicamadas. O trabalho de cultura de células deve ser realizado em uma capela de fluxo laminar para manter a esterilidade. Semeando o frasco de cultura celular multicamadasPré-aquecer 550 mL de meio de crescimento completo (varia de acordo com a linhagem celular em uso) e 100 mL de PBS estéril em banho-maria a 37 °C por 20 min. Usando a suspensão de células colhidas, calcule o volume necessário da suspensão celular necessário para atingir a densidade de semeadura ideal de 1 × 107 células usando a equação (1), onde WANT refere-se ao número de células necessárias para semear o frasco multicamadas, e HAVE refere-se ao número de células/mL na suspensão celular:(1º)por exemplo, Adicionar o volume necessário da suspensão celular a 100 mL do meio de crescimento pré-aquecido. Pegue um novo frasco multicamadas no capô, retire a tampa e segure o frasco em um ângulo de 60°. Pipetar lentamente todos os 100 mL da suspensão celular para o frasco, descendo pelo lado angulado do pescoço. Tampe o balão e coloque-o de lado para permitir que as células se distribuam uniformemente pelas camadas. Em um ângulo de 60°, adicionar 400 mL do meio de crescimento pré-aquecido ao balão multicamadas, despejando lentamente ou pipetando pelo lado angulado do pescoço. Se o pescoço ficar cheio, devolva o frasco à posição vertical ou tampe o frasco e coloque-o de lado antes de voltar a derramar.NOTA: Despeje lentamente para evitar a formação excessiva de bolhas. Bater suavemente no balão na posição vertical para permitir que todas as bolhas subam para o topo e retire-as com uma pipeta de 10 ml. Certifique-se de que o balão está preenchido até ao fio inferior do pescoço; Adicione mais meio, se necessário, para conseguir isso. Tampe o frasco multicamadas e incube-o com o pescoço angulado virado para baixo a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade. Verifique o crescimento a cada 2-3 dias para confluência. Para verificar a confluência das duas camadas inferiores do frasco multicamadas, visualize-as sob uma lente objetiva 4x de um microscópio invertido.NOTA: Quando semeado com 1 × 107 células de neuroblastoma, o frasco de 10 camadas normalmente leva uma semana para se tornar confluente – embora isso possa variar dependendo da linhagem celular usada. Manutenção rotineira das células do frasco multicamadasPré-aquecer 550 mL de meio de crescimento completo (varia de acordo com a linhagem celular em uso), 50-100 mL de tripsina e 300 mL de PBS estéril em banho-maria a 37 °C por 20 min. Verifique se o frasco multicamadas tem 70-80% de confluência. Colocar o balão multicamadas numa capela de fluxo laminar e eliminar o meio gasto do balão por derramamento. Inicialmente, incline o frasco para que o meio seja despejado sobre a barragem de ar em um recipiente de resíduos. Durante o despejo, gire o balão em 180° até que o meio esteja fluindo pelo pescoço angulado do frasco. Gire o balão para frente e para trás ao longo deste eixo para eliminar qualquer líquido restante. Lave as células adicionando 100 mL de PBS estéril pré-aquecido lentamente pelo pescoço angulado. Tampe o frasco, coloque-o de lado para permitir uma distribuição uniforme do PBS e gire o frasco para trás e para a frente para lavar as células. Eliminar a lavagem PBS da mesma forma que o ponto 3.2.3. Repita as etapas de lavagem. Diluir 50 mL de tripsina pré-aquecida em 50 mL de PBS estéril pré-aquecido. Adicionar 100 ml de solução diluída de tripsina ao balão multicamadas, tampar e colocar o balão de lado para permitir uma distribuição uniforme da tripsina. Se a linhagem celular for altamente aderente, use 100 mL de tripsina não diluída. Incubar o frasco por 2-5 min a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade, monitorando o desprendimento celular ao microscópio. Se necessário, bata firmemente no frasco para ajudar no descolamento ou coloque-o novamente na incubadora por mais um minuto. Colocar o frasco multicamadas em capela de fluxo laminar e neutralizar a tripsina com 100 mL de meio de cultura. Tampe o frasco, coloque-o de lado e balançar para trás e para frente para garantir a neutralização completa. Despeje a suspensão de células neutralizadas em tubos de centrífuga cônica de 4 x 50 mL.NOTA: Se for necessária a colheita completa de células, lavar novamente o balão multicamadas com 100 ml de PBS estéril e deitá-lo em tubos de centrifugação de 2 x 50 ml. Centrifugar a suspensão celular em tubos de centrífuga de 50 mL a 340 × g por 3-4 min para peletizar as células. Retorne os tubos da centrífuga para a capela de fluxo laminar e descarte cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível de cada pellet.NOTA: O pellet será grande e relativamente solto e, portanto, pode ser interrompido facilmente. Adicione 1-5 mL de meio de crescimento a cada pellet e ressuspenda-o pipetando para cima e para baixo várias vezes. Junte os 4 pellets ressuspensos em um tubo de centrífuga de 50 mL, misture-os cuidadosamente com a pipeta e observe o volume total. Fazer uma diluição apropriada da suspensão celular para contagem de células, de modo que cada quadrado externo no hemocitômetro contenha 30-100 células.NOTA: Uma diluição de partida adequada é de 1:100; para isso, pipetar 10 μL da suspensão celular em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL e diluí-lo com 990 μL de PBS estéril. Pipetar a mistura para cima e para baixo várias vezes para misturar completamente. Coloque um tubo de centrífuga de 50 mL contendo o estoque de células na incubadora durante a contagem. Tomando um hemocitômetro limpo, coloque uma lamínula limpa sobre a grade, como mostra a Figura 2. Pipetar 10 μL da suspensão celular diluída para a câmara do hemocitômetro. Se a câmara ficar cheia antes de todos os 10 μL serem dispensados, pare de pipetar. Coloque o hemocitômetro sob a objetiva 4x de um microscópio de luz. Ajuste o foco grosso e fino para visualizar as células. Conte o número de células nos quatro quadrados de canto externo da câmara, conforme destacado na Figura 2. Adicione as quatro contagens e divida por 4 para calcular a média de células por quadrado. Figura 2: Contagem celular por hemocitômetro. Dez microlitros de suspensão celular são adicionados ao hemocitômetro sob a lamínula. A câmara é então colocada sob a lente objetiva 4x de um microscópio, e o número de células nos quatro cantos externos da grade é contado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Multiplique a contagem média pelo fator de diluição (por exemplo, 100) e multiplique esse número por 10.000 para obter o número de células por mL usando a equação (2). (2º) Calcule o número total de células na solução-estoque multiplicando pelo volume total do estoque de células (por exemplo, se os 4 pellets ressuspensos agrupados produzirem uma solução de 20 mL, multiplique células/mL por 20). Para manter o balão multicamadas, utilizar a equação (1) descrita no passo 3.1.2 para calcular o volume de células necessário para semear 1 ×10 7 células de volta ao balão e executar os passos 3.1.3-3.1.6 para voltar a semear o balão. Se estiver pronto para semear os andaimes, prossiga para a próxima seção. 4. Células de neuroblastoma de sementes em arcabouços Preparar suspensão de célula de estoqueNOTA: Este protocolo delineará as etapas para a criação de quatro diferentes densidades de semeadura de células de neuroblastoma, com um fator de multiplicação de 2 entre cada densidade. Por conseguinte, será utilizada uma diluição em série para criar mais três suspensões de células a partir da suspensão de stock. O trabalho de cultura de células deve ser realizado em uma capela de fluxo laminar para manter a esterilidade.Utilizar a equação (3) para calcular o volume de células necessário a partir do número total de células no balão multicamadas (contado no ponto 3.2.19) para preparar a primeira densidade de semeadura ou suspensão de existências celulares.(3º)NOTA: Por exemplo, se a maior densidade de semeadura for de 6 × 105 células por andaime necessária para 30 andaimes, com cada andaime recebendo 20 μL de suspensão celular, a suspensão de células estoque exigiria 1,8 × 107 células (6 × 105 células × 30 andaimes) em um volume total de 600 μL (20 μL × 30 andaimes).Como será realizada uma diluição seriada a partir dessa preparação, esses números deverão ser duplicados, ou seja, 3,6 × 107 células em um volume total de 1200 μL. Para converter isso em WANT em células por mL; dividir 3,6 × 10 7 por 1200 μL e multiplicar por 1000 μL, dando 3 × 107 células por mL.​ Adicionar o volume necessário de estoque celular a um tubo de centrífuga estéril de 2 mL ou 15 mL e levar a um volume final de 1200 μL com meio de crescimento. Rotule este tubo como Densidade 1 (Figura 3). Execute a diluição em série para criar várias suspensões de células de densidade de semeadura.A partir da densidade 1 preparada na etapa 4.1.1, preparar mais três densidades de suspensão celular através de diluição seriada, conforme Figura 3. Diluir cada densidade por um fator de 2 no meio de crescimento. Primeiro, adicione o volume final necessário (600 μL do exemplo anterior) de meio de crescimento a três tubos centrífugos estéreis de 2 mL ou 15 mL. Transfira metade da Densidade 1 (600 μL) para um dos tubos, misturando completamente a suspensão celular com o meio para diluir. Rotule este tubo como Densidade 2. Transfira metade da Densidade 2 (600 μL) para o próximo tubo, misturando completamente a suspensão da célula com o meio para diluir. Rotule este tubo como Densidade 3. Transfira metade da Densidade 3 (600 μL) para o tubo seguinte, misturando completamente a suspensão celular com o meio para diluir. Rotule este tubo como Densidade 4. Descarte 600 μL da Densidade 4 para que todas as quatro preparações tenham um volume final de 600 μL. Como controle negativo, adicionar 600 μL de meio de crescimento somente a um tubo centrífugo estéril de 2 mL. Consulte a Figura 3 para obter um esquema do processo de diluição seriada. Figura 3: Diluição em série do estoque celular para preparar 4 suspensões para 4 densidades de semeadura de andaimes diferentes. (A) Os números podem ser ajustados de acordo com a densidade de semeadura desejada por andaime e (B) multiplicados pelo número total de andaimes por densidade, com cada andaime recebendo 20 μL de suspensão celular. Neste exemplo, a Densidade 1 requer 6 × 105 células por scaffold, o equivalente a 1,8 × 107 células em 600 μL para 30 scaffolds. Esse número é dobrado para iniciar a diluição seriada, pois 600 μL são então transferidos e diluídos em 600 μL de meio de crescimento no tubo seguinte. Este processo continua até que haja suspensões de 4 células com um fator de 2 entre cada uma. Um controle negativo é feito adicionando 600 μL de meio apenas a um tubo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Adição de suspensões de células aos andaimesNOTA: Retire os andaimes (armazenados em PBS) do frigorífico e deixe-os chegar à temperatura ambiente (RT) antes de adicionar as células.Traga os andaimes em PBS para a capela de fluxo laminar. Com pinças estéreis, colocar os andaimes em placas não aderentes de 24 poços com um andaime por poço (Figura 1C). Levante suavemente os andaimes pelos cantos e pressione-os levemente contra o lado do recipiente para remover o excesso de PBS. Adicione os andaimes no centro dos poços de lado para baixo (o lado brilhante da camada do andaime, virado para baixo nas placas de plástico de 24 poços). Rotule as placas de 24 poços com detalhes da linha celular, parâmetros relevantes (por exemplo, densidade de semeadura) e pontos de tempo. Trabalhar com uma densidade de semeadura de células por vez, mantendo as densidades restantes na incubadora de 37 °C até que estejam prontas para uso. Na capela de fluxo laminar, use uma pipeta P20 e pontas estéreis para adicionar suavemente 20 μL da suspensão celular relevante ao centro de cada andaime (Figura 1D). Mantenha as células completamente em suspensão, misturando bem enquanto adiciona as células aos andaimes. Certifique-se de que a suspensão permaneça em cima do andaime e não deslize para a base do poço, pois isso não permitirá a fixação da célula ao andaime. Uma vez que as células tenham sido adicionadas, incube as placas por 3-5 h (37 °C, 5% de CO2 e 95% de umidade) para permitir que a maioria das células se fixe. Após a incubação, adicionar lenta e suavemente 1 mL de meio de cultura pré-aquecido a cada poço (Figura 1E). Use uma pipeta P1000 para adicionar o meio para permitir um movimento mais lento e controlado, evitando o deslocamento dos andaimes. Se estiver trabalhando com um número muito alto de andaimes, use uma pipeta de 10 mL com a pistola de pipeta definida como ‘drop’ e ‘low’. Incubar as placas de 24 poços durante a noite (37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade). Manutenção de células nos andaimesApós as primeiras 24 h de fixação celular (Dia 1), transferir os arcabouços semeados para novas placas de 24 poços não aderentes e adicionar 1-2 mL de meio de crescimento fresco.NOTA: Esta etapa remove as células que caíram no fundo das placas de plástico de 24 poços, em vez de permitir que elas cresçam nos andaimes. As réplicas de andaimes designadas como Dia 1 serão retiradas após 24 h, conforme discutido na seção 5; portanto, a manutenção não se aplica a esses andaimes. Monitore os andaimes inicialmente a cada 2-3 dias para uma mudança na cor do meio de crescimento. À medida que o tempo avança e as células proliferam dentro dos arcabouços, alimentam-se com mais frequência. Com uma pistola de pipeta de 10 mL, no modo lento, retire o 1 mL do meio gasto e descarte. Se estiver realizando experimentos que exijam meio condicionado, coletar o meio gasto de réplicas biológicas em um tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugar a 340 × g por 2 min para peletizar os detritos celulares, transferir o sobrenadante para um tubo fresco e armazenar a -80 °C. Adicione suavemente 2 mL de meio de crescimento pré-aquecido aos andaimes, usando a função de gotejamento novamente na pipeta, e devolva a placa de 24 poços à incubadora (37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade). Repita sempre que o meio for gasto durante o período de crescimento desejado. 5. Recuperação de andaimes e aplicações NOTA: Em cada ponto de tempo, várias aplicações podem ser usadas para monitorar o crescimento celular nos scaffolds ou avaliar perfis de expressão gênica e proteica. As condições de recuperação do andaime dependerão da análise a ser realizada, com múltiplos métodos de recuperação descritos nas subseções a seguir e demonstrados na Figura 4. Avaliação da viabilidade celular em scaffoldsEsterilizar o reagente apropriado do ensaio de viabilidade celular filtrando através de um filtro estéril de 0,2 μm em um tubo de centrífuga na capela de fluxo laminar. Pré-aqueça esta solução estéril juntamente com meio de crescimento completo e PBS estéril em banho-maria a 37 °C. Na capela de fluxo laminar, use pinças estéreis para transferir os andaimes a serem analisados para uma placa fresca de 24 poços. Rotule a placa com todos os detalhes relevantes.OBS: Realizar a análise em triplicata. Adicionar 900 μL do meio de crescimento pré-aquecido a cada poço, seguido de 100 μL do reagente de viabilidade celular estéril. Incluir um controle negativo adicionando 900 μL de meio e 100 μL do reagente de viabilidade celular estéril a um poço sem arcabouço. Substitua a tampa da placa e agite suavemente a placa por ~3 min para distribuir uniformemente o reagente de viabilidade celular diluída por todo o poço. Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade.NOTA: Os tempos de incubação precisarão ser otimizados para cada linhagem celular; Consulte as diretrizes do fabricante. Para linhagens celulares de neuroblastoma, a incubação de 4-6 h parece ideal. Após a incubação, retire a placa da incubadora e agite-a suavemente por alguns segundos. Na capela de fluxo laminar, abra uma nova placa translúcida de 96 poços. De cada poço na placa de 24 poços, transferir o meio incubado e o reagente para três poços da placa de 96 poços com 100 μL por poço, dando triplicatas técnicas.NOTA: Esta transferência deixará 700 μL nos poços da placa de 24 poços. Cubra a placa de 96 poços em folha de alumínio para proteger o reagente de viabilidade celular da luz. Remova e elimine os restantes 700 μL do conteúdo do poço de cada andaime na placa de 24 poços. Lave cada andaime duas vezes com 1 mL de PBS estéril.NOTA: Todas as cores não serão removidas dos andaimes. Estes arcabouços podem então ser utilizados para outras aplicações, por exemplo, quantificação de ADN, colocando-os em 1 ml de Triton X-100 a 1% em solução de bicarbonato de sódio 0,1 M (NaHCO3) e armazenando-os a -80 °C (ver secção 5.2, Figura 4B). Remova a placa de 96 poços da capela de fluxo laminar e meça a absorbância de cada poço nos comprimentos de onda de 570 nm e 600 nm usando um leitor de microplacas. Registar os valores de absorbância em ambos os comprimentos de onda e seguir as instruções do fabricante para calcular a redução percentual do reagente de viabilidade celular pelas células. Analisar graficamente e estatisticamente os resultados de viabilidade celular utilizando software apropriado. Valores de triplicata biológica de entrada para produzir barras de erro e indicar a variabilidade do ensaio. Para examinar as mudanças na viabilidade celular ao longo do período experimental, realize um teste de análise de variância (ANOVA) one-way com comparações múltiplas das médias usando software bioestatístico apropriado. Indicam diferenças significativas entre os momentos nos gráficos como ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) e **** (P≤0,0001). Figura 4: Recuperação de scaffolds para diferentes análises em cada ponto de tempo. (A) Três réplicas de andaimes são recuperadas para análise da viabilidade celular. (B) Esses scaffolds podem então ser lavados em PBS, colocados em Triton X-100 a 1% em NaHCO3 0,1 M e armazenados a -80 °C para quantificação de DNA. (C) Mais três réplicas são fixadas em PFA a 10% por 15 min, neutralizadas em PBS e armazenadas a 4 °C para coloração histológica e exames de imagem. (D) Finalmente, 3 réplicas são adicionadas a um reagente de lise celular à base de fenol/guanidina e armazenadas a -20 °C para análise da expressão gênica. Abreviações: PBS = solução salina tamponada com fosfato; PFA = paraformaldeído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Quantificação do DNA das células dos scaffoldsNOTA: Tal como referido na nota após o passo 5.1.7, a recuperação dos suportes para quantificação do ADN envolve a colocação dos suportes em tubos de centrifugação de 2 ml contendo 1 ml de Triton X-100 a 1% em solução de NaHCO3 0,1 M, seguida de armazenamento a -80 °C. Antes que a análise de DNA possa ser realizada, as células devem passar por três ciclos de congelamento-descongelamento para lisar as células do neuroblastoma adequadamente e liberar DNA para quantificação.Retirar as amostras previamente armazenadas em Triton X-100 a partir de -80 °C. Deixe as amostras em TR por 1-3 h ou até descongelar. Vórtice as amostras por 10-20 s e coloque as amostras de volta a -80 °C por 18-24 h ou até congelar completamente. Repita este processo para um total de três ciclos de congelamento-descongelamento. Para maximizar o rendimento de DNA, use um lisador de tecido para interromper as células nos scaffolds.Coloque um grânulo metálico no tubo centrífugo de 2 mL contendo um andaime em Triton X-100 e coloque o tubo dentro do adaptador para agitar a amostra a 50 oscilações/segundo por 2-3 min.NOTA: Use tubos de centrífuga de fundo redondo, pois o talão de metal pode ficar alojado em um tubo de fundo cônico. Quantificar o DNA na solução Triton X-100 aplicando uma coloração fluorescente de DNA de fita dupla (dsDNA) e medir a emissão usando um leitor de microplacas. Consulte as orientações do fabricante; diluir adequadamente as amostras em tampão de ácido tetracético (TE) de tris-etilenodiamina para preparar 8 padrões de dsDNA através de diluição seriada em tampão TE (Figura 5). Em placas pretas opacas de 96 poços, adicionar 100 μL de cada padrão ou amostra aos poços em triplicata técnica. Diluir a coloração fluorescente de dsDNA 200 vezes em tampão TE e adicionar 100 μL a cada padrão/amostra usando uma pipeta multicanal. Cubra a placa em folha de flandres e incube em RT por 5 min. Medir e registrar a fluorescência de cada poço a 520 nm. Siga as orientações do fabricante para calcular a concentração de DNA em cada amostra.NOTA: Se a concentração média de ADN por célula for conhecida para a linhagem celular utilizada, os valores de concentração de ADN podem ser convertidos em números celulares utilizando a equação (4).(4º) Grafar e analisar estatisticamente os resultados da quantificação do DNA utilizando software apropriado. Valores de triplicata biológica de entrada para produzir barras de erro e indicar a variabilidade do ensaio. Para examinar as mudanças na concentração de DNA/número de células ao longo do período experimental, realize um teste ANOVA unidirecional com comparações múltiplas das médias usando software bioestatístico apropriado. Indicam diferenças significativas entre os momentos nos gráficos como ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) e **** (P≤0,0001). Figura 5: Elaboração de oito padrões de DNA para a geração de uma curva padrão. Uma solução-mãe de λDNA é fornecida a 100 μg/mL. Este é diluído 50 vezes em tampão TE para criar o padrão A a 2000 ng/mL; 400 μL de A são então transferidos para o tubo B, contendo 400 μL de tampão TE; 400 μL de B é então transferido e diluído 2 vezes em C, e assim por diante até G. O padrão H é composto apenas de tampão TE e, portanto, tem uma concentração de DNA de 0 ng/mL. Abreviação: TE = Tris-EDTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Preparo de scaffolds para coloração histológicaNOTA: Os scaffolds podem ser fixados e corados para fins de microscopia e imagem como scaffolds inteiros para imunofluorescência (IF) ou como cortes fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) para coloração histológica ou imunohistoquímica (IHQ). Isso permite a avaliação qualitativa da penetração e distribuição celular dentro de scaffolds e pode ser usado para avaliar a expressão de proteínas.Preparar uma solução de paraformaldeído (PFA) a 10% em PBS. Certifique-se de que existe solução suficiente para um volume final de 500 μL por andaime. Pré-aquecer esta solução a 37 °C e adicionar 500 μL a tubos de centrífuga marcados de 2 ml para recuperação de andaimes. Retire os andaimes das placas não aderentes de 24 poços (passo 4.4.4) e coloque-os no capô de fluxo laminar. Usando pinças estéreis, transfira os suportes para os tubos de centrífuga marcados contendo 10% de PFA. Deixe os andaimes fixarem na solução de PFA por 15 min. Neutralizar o PFA adicionando 500 μL de PBS a cada tubo e armazenar a 4 °C. Para preparar os andaimes para o Processador Automático de Tecidos, retire-os de 4 °C e use uma pinça para colocá-los em de plástico rotulados com todos os detalhes relevantes a lápis. Coloque todas as no recipiente metálico do Processador de Tecidos. Inicie o protocolo de 12 estágios no processador de tecidos para fixar, desidratar, limpar os andaimes e infiltrá-los com parafina durante a noite. Recolher as contendo as amostras processadas. Em seguida, incorpore os scaffolds em blocos de cera de parafina para permitir a microtomia dos scaffolds em fatias muito finas para coloração.NOTA: É especialmente importante considerar a orientação dos andaimes ao removê-los dos e incorporá-los em cera, pois isso afetará o ângulo em que as imagens são tiradas. Isso é importante ao avaliar a infiltração celular nos scaffolds. Ligue o embutidor de cera e a placa fria; Levante a tampa para verificar o nível da cera. Reabasteça, se necessário. Trabalhando com uma amostra de cada vez, abra o, retire o andaime e centralize-o no molde plástico. Despeje cera quente sobre a amostra, garantindo que a orientação correta seja mantida e ajustando com pinças quentes, se necessário, antes que a cera se solidifique. Despeje mais cera para preencher o molde. Coloque a tampa do etiquetado por cima do molde de plástico e adicione cera por cima. Coloque o molde sobre a placa fria para solidificar a cera. Conservar durante a noite a 4 °C para garantir que a cera de parafina está totalmente solidificada antes da microtomia. Para se preparar para a microtomia, ligue um banho-maria a 35 °C, a placa de secagem e o micrótomo. Insira uma lâmina no suporte e aperte a alavanca para prendê-la. Ajuste a espessura do caimento e da seção, geralmente 5 mm para seções de andaime. Retire o andaime FFPE do molde, fixe-o no suporte na parte frontal do micrótomo e corte cuidadosamente o excesso de cera ao redor das bordas da amostra antes de cortar as seções. Comece a cortar no bloco de cera girando a alavanca do micrótomo, garantindo um movimento suave. Colete seções em forma de fita, cerca de 3 seções de andaime de cada vez, e coloque-as delicadamente no banho-maria a 35 °C para remover rugas. Separe suavemente as seções enquanto estiver em banho-maria usando uma pinça. Usando lâminas de microscópio de vidro revestidas de polisina, levante cada seção do banho-maria para que a seção fique no centro da lâmina. Rotule cada slide com um lápis. Coloque as lâminas de vidro na placa de secagem ou num forno de secagem a 60 °C. Depois de secos, armazená-los a 4 °C e proceder com a coloração histológica ou IHQ necessária. Recuperação de scaffolds para análise da expressão gênicaRetirar os andaimes das placas não aderentes de 24 poços da incubadora (passo 4.4.4) e colocá-los na capela de fluxo laminar. Usando pinças estéreis, transfira os andaimes para tubos de centrífuga de 2 mL recém-marcados. Em um exaustor, adicione 1 mL de um reagente de lise celular à base de fenol/guanidina a cada tubo para lisar as células em arcabouços e permitir a recuperação de RNA de alta qualidade. Conservar os tubos a -20 °C até que estejam prontos para efectuar a extracção de ARN utilizando um kit apropriado. Usando uma reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR)17, avalie a expressão gênica nas células dos scaffolds.