Modello biomimetico tridimensionale in vitro di neuroblastoma utilizzando scaffold a base di collagene

1. Disegno sperimentale NOTA: Il numero di scaffold e celle necessari per ciascun esperimento dipenderà dalla scala dell’esperimento e può essere calcolato utilizzando gli strumenti in questa sezione sul disegno sperimentale. Numero di impalcature necessarieDeterminare la tempistica sperimentale complessiva e gli intervalli di valutazione per i cambiamenti nella biologia cellulare (ad esempio, crescita cellulare e metabolismo).NOTA: Ad esempio, il periodo sperimentale è di 14 giorni, con una valutazione della crescita cellulare ogni 7 giorni. Pertanto, i punti temporali sperimentali sono i giorni 1, 7, 14 per un totale di 3 punti temporali. Successivamente, decidi il numero di applicazioni sperimentali da applicare in ogni momento. Prova a completare le stesse analisi in ogni momento per monitorare i cambiamenti.NOTA: Le analisi tipiche della crescita cellulare sugli scaffold includono saggi di vitalità cellulare, quantificazione del DNA, colorazione istologica e imaging e analisi dell’espressione genica. Questi saranno ulteriormente discussi nella sezione 5. Decidere quando utilizzare lo stesso scaffold per più applicazioni a valle, ad esempio, dopo la valutazione della vitalità cellulare utilizzando un saggio appropriato, riutilizzare lo scaffold per l’isolamento di DNA/RNA (discusso in 5.1.11). Mantenere un minimo di 3 repliche biologiche per ogni applicazione, ad esempio 3 scaffold per la vitalità cellulare e la quantificazione del DNA, 3 per l’istologia e 3 per l’analisi dell’espressione genica. Poiché ciò equivale a 9 impalcature per punto temporale, pianificare l’utilizzo di 27 impalcature per 3 punti temporali. Infine, moltiplicare questo numero per il numero di parametri o condizioni sperimentali (ad esempio, valutazione di più linee cellulari, densità di semina iniziale, composizioni di scaffold).NOTA: In questo protocollo, sono state valutate 4 diverse densità di semina iniziali per una linea cellulare, con il risultato di 108 (27 scaffold x 4 condizioni) scaffold necessari. Per tenere conto dell’errore umano e fornire una copertura extra, aggiungere ~10% a questo numero, ad esempio, se sono necessari 108 scaffold, preparare 120 scaffold. Numero di celle necessarieNOTA: Si consiglia un volume di 20 μL di sospensione cellulare per la semina delle cellule su un’impalcatura cilindrica (diametro 6 mm, altezza 4 mm) il giorno 0. Il numero di cellule per questi 20 μL di sospensione cellulare è regolato in base al disegno sperimentale, calcolato nella sezione 1.1. Una densità di semina iniziale comune è di 2 × 105 cellule per 20 μL, utilizzata come esempio per il protocollo seguente.Per calcolare la quantità totale di cellule necessarie per l’esperimento, moltiplicare le 2 × 105 cellule iniziali per 20 μL per il numero di scaffold necessari.NOTA: Ad esempio, 30 scaffold moltiplicati per 20 μL danno un volume totale di 600 μL. Se ogni scaffold richiede 2 × 10 5 cellule, 600 μL di sospensione contengono un totale di 6 × 10 6 cellule (2 × 105 × 30), per un fabbisogno finale di 6 × 106 cellule in 600 μL. Il numero dei parametri sperimentali determinerà il numero totale di celle necessarie. Questo protocollo, quindi, delinea la coltura cellulare utilizzando un pallone per coltura cellulare multistrato, in grado di gestire lo stesso numero di cellule di 10 matracci tradizionalida 175 cm 2. 2. Preparazione di scaffold a base di collagene NOTA: Gli scaffold cilindrici Coll-I-nHA e Coll-I-GAG (diametro 6 mm, altezza 4 mm) sono preparati utilizzando i metodi stabiliti 15,21,27. Una volta reticolati chimicamente secondo i metodi17 precedentemente pubblicati, gli scaffold devono essere utilizzati entro 1 settimana. Dopo la fabbricazione degli scaffold con le proprietà meccaniche desiderate, assicurarsi che gli scaffold siano completamente idratati e accuratamente lavati in soluzione salina tamponata con fosfati (PBS).NOTA: Questa operazione richiede generalmente ~12 ore dopo la reticolazione degli scaffold e può essere eseguita in contenitori per rifiuti di coltura tissutale da 100 mL a 4 °C, con un massimo di 50 scaffold per contenitore e 2 mL di PBS per scaffold. Conservare gli scaffold in PBS a 4 °C fino al momento dell’uso. 3. Propagare le cellule di neuroblastoma in un pallone di coltura cellulare multistrato NOTA: La densità di semina ottimale per il pallone multistrato può variare. Per il pallone utilizzato in questo esperimento, la densità ottimale secondo le istruzioni del produttore è 1 × 107 celle. Prima di seminare il pallone multistrato, propagare le cellule a una densità di 1 × 10-7 cellule o superiore in un pallone per coltura tissutale appropriato (ad esempio, un pallone per coltura tissutale T175 cm2). Per seminare le cellule nel pallone multistrato (paragrafo 3.1), farle crescere fino al 70-80% confluente, raccogliere e contare il numero di cellule per ml, facendo riferimento ai passaggi 3.2.16-3.2.20 per eseguire la conta delle cellule. Una volta contata la sospensione cellulare, procedere immediatamente alla semina del pallone multistrato. Il lavoro di coltura cellulare deve essere eseguito in una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità. Semina del pallone per coltura cellulare multistratoPreriscaldare 550 mL di terreno di coltura completo (varia a seconda della linea cellulare in uso) e 100 mL di PBS sterile a bagnomaria a 37 °C per 20 min. Utilizzando la sospensione cellulare raccolta, calcolare il volume richiesto della sospensione cellulare necessaria per ottenere la densità di semina ottimale di 1 × 107 celle utilizzando l’equazione (1), dove WANT si riferisce al numero di cellule necessarie per la semina del pallone multistrato e HAVE si riferisce al numero di cellule/mL nella sospensione cellulare:(1)ad esempio, Aggiungere il volume richiesto della sospensione cellulare a 100 mL del terreno di coltura preriscaldato. Prendi un nuovo pallone multistrato nel cofano, rimuovi il tappo e tieni il pallone con un angolo di 60°. Pipettare lentamente tutti i 100 ml di sospensione cellulare nel pallone, lungo il lato angolato del collo. Tappare il pallone e posizionarlo su un lato per consentire alle cellule di distribuirsi uniformemente tra gli strati. Con un angolo di 60°, aggiungere 400 mL del terreno di coltura preriscaldato al pallone multistrato versando lentamente o pipettando lungo il lato angolato del collo. Se il collo si riempie, riportare il pallone in posizione verticale o tappare il pallone e posizionarlo su un lato prima di tornare a versare.NOTA: Versare lentamente per evitare un’eccessiva formazione di bolle. Picchiettare delicatamente il pallone in posizione verticale per consentire a tutte le bolle di salire verso l’alto e rimuoverle con una pipetta da 10 ml. Assicurarsi che il pallone sia riempito fino alla filettatura inferiore del collo; Aggiungere altro terreno, se necessario, per raggiungere questo obiettivo. Tappare il pallone multistrato e incubarlo con il collo angolato rivolto verso il basso a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità. Controllare la crescita ogni 2-3 giorni per la confluenza. Per controllare la confluenza dei due strati inferiori del pallone multistrato, osservarli sotto una lente obiettivo 4x di un microscopio invertito.NOTA: Se seminato con 1 × 107 cellule di neuroblastoma, il pallone a 10 strati impiegherà in genere una settimana per diventare confluente, anche se questo può variare a seconda della linea cellulare utilizzata. Manutenzione ordinaria delle cellule nel matraccio multistratoPreriscaldare 550 mL di terreno di coltura completo (varia a seconda della linea cellulare in uso), 50-100 mL di tripsina e 300 mL di PBS sterile in un bagno d’acqua a 37 °C per 20 minuti. Controllare che il pallone multistrato abbia una confluenza del 70-80%. Collocare il pallone multistrato in una cappa a flusso laminare ed eliminare il fluido esausto dal pallone versandolo. Inizialmente, inclinare il pallone in modo che il fluido si versi sopra la diga d’aria in un contenitore per rifiuti. Durante il versamento, ruotare il pallone di 180° fino a quando il fluido scorre lungo il collo angolato del pallone. Ruotare il pallone avanti e indietro lungo questo asse per eliminare il liquido residuo. Lavare le cellule aggiungendo lentamente 100 ml di PBS sterile preriscaldato lungo il collo angolato. Tappare il pallone, posizionarlo su un lato per consentire una distribuzione uniforme del PBS e ruotare il pallone avanti e indietro per lavare le celle. Smaltire il lavaggio PBS nello stesso modo di 3.2.3. Ripetere le fasi di lavaggio. Diluire 50 mL di tripsina preriscaldata in 50 mL di PBS sterile preriscaldato. Aggiungere 100 mL di soluzione di tripsina diluita al pallone multistrato, al tappo e posizionare il pallone su un lato per consentire una distribuzione uniforme della tripsina. Se la linea cellulare è altamente aderente, utilizzare 100 ml di tripsina non diluita. Incubare il matraccio per 2-5 minuti a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità, monitorando il distacco delle cellule al microscopio. Se necessario, picchiettare con decisione il pallone per favorirne il distacco o rimetterlo nell’incubatrice per un altro minuto. Posizionare il pallone multistrato in una cappa a flusso laminare e neutralizzare la tripsina con 100 mL di terreno di coltura. Tappate il pallone, posizionatelo su un lato e oscillate avanti e indietro per garantire la completa neutralizzazione. Versare la sospensione cellulare neutralizzata in 4 provette da centrifuga coniche da 50 ml.NOTA: Se è necessario un prelievo completo delle cellule, lavare nuovamente il matraccio multistrato con 100 mL di PBS sterile e versarlo in 2 provette da centrifuga da 50 mL. Centrifugare la sospensione cellulare in provette da centrifuga da 50 mL a 340 × g per 3-4 minuti per pellettare le cellule. Rimettere le provette da centrifuga nella cappa a flusso laminare ed eliminare con cura quanto più surnatante possibile da ciascun pellet.NOTA: Il pellet sarà grande e relativamente sciolto e quindi può essere interrotto facilmente. Aggiungere 1-5 ml di terreno di coltura a ciascun pellet e risospenderlo pipettando su e giù più volte. Raggruppare i 4 pellet risospesi in una provetta da centrifuga da 50 ml, mescolarli accuratamente con la pipetta e annotare il volume totale. Effettuare un’opportuna diluizione della sospensione cellulare per il conteggio delle cellule in modo che ogni quadrato esterno dell’emocitometro contenga 30-100 cellule.NOTA: Una diluizione iniziale adeguata è 1:100; a tale scopo, pipettare 10 μL della sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga conica da 15 mL e diluirla con 990 μL di PBS sterile. Pipettare la miscela su e giù più volte per mescolare accuratamente. Posizionare una provetta da centrifuga da 50 mL contenente il brodo di cellule nell’incubatrice durante il conteggio. Prendendo un emocitometro pulito, posizionare un vetrino coprioggetti pulito sulla griglia, come mostrato nella Figura 2. Pipettare 10 μL della sospensione cellulare diluita nella camera dell’emocitometro. Se la camera si riempie prima dell’erogazione di tutti i 10 μL, interrompere il pipettaggio. Posizionare l’emocitometro sotto l’obiettivo 4x di un microscopio ottico. Regolare la messa a fuoco grossolana e fine per visualizzare le celle. Contare il numero di celle nei quattro quadrati degli angoli esterni della camera, come evidenziato nella Figura 2. Somma i quattro conteggi e dividi per 4 per calcolare la media delle celle per quadrato. Figura 2: Conteggio delle cellule con un emocitometro. Dieci microlitri di sospensione cellulare vengono aggiunti all’emocitometro sotto il vetrino coprioggetto. La camera viene quindi posizionata sotto l’obiettivo 4x di un microscopio e viene contato il numero di cellule nei quattro angoli esterni della griglia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Moltiplicare il conteggio medio per il fattore di diluizione (ad esempio, 100) e moltiplicare questo numero per 10.000 per ottenere il numero di cellule per mL utilizzando l’equazione (2). (2) Calcolare il numero totale di cellule nella soluzione madre moltiplicando per il volume totale della cella (ad esempio, se i 4 pellet risospesi raggruppati formano una soluzione da 20 mL, moltiplicare le cellule/mL per 20). Per mantenere il pallone multistrato, utilizzare l’equazione (1) descritta al punto 3.1.2 per calcolare il volume di cellule necessarie per riseminare 1 × 107 cellule nel pallone ed eseguire i passaggi da 3.1.3 a 3.1.6 per riseminare il pallone. Se si è pronti a seminare le impalcature, passare alla sezione successiva. 4. Cellule di neuroblastoma da seme su scaffold Preparare la sospensione di cellule madriNOTA: Questo protocollo delineerà i passaggi per la creazione di quattro diverse densità di semina delle cellule di neuroblastoma, con un fattore di moltiplicazione di 2 tra ciascuna densità. Una diluizione seriale sarà quindi utilizzata per creare altre tre sospensioni cellulari dalla sospensione di serie. Il lavoro di coltura cellulare deve essere eseguito in una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità.Utilizzare l’equazione (3) per calcolare il volume di cellule necessario dal numero totale di cellule nel matraccio multistrato (conteggiato al punto 3.2.19) per preparare la prima densità di semina o la sospensione del materiale cellulare.(3)NOTA: Ad esempio, se la massima densità di semina è di 6 × 105 celle per scaffold richiesta per 30 scaffold, con ogni scaffold che riceve 20 μL di sospensione cellulare, la sospensione di celle stock richiederebbe 1,8 × 107 celle (6 × 105 celle × 30 scaffold) in un volume totale di 600 μL (20 μL × 30 scaffold).Poiché da questo preparato verrà eseguita una diluizione seriale, questi numeri devono essere raddoppiati, cioè 3,6 × 107 cellule in un volume totale di 1200 μL. Per convertirlo in WANT in cellule per mL; dividere 3,6 × 10 7 per 1200 μL e moltiplicare per 1000 μL, ottenendo 3 × 107 cellule per mL.​ Aggiungere il volume richiesto di cellule in una provetta da centrifuga sterile da 2 mL o 15 mL e portare a un volume finale di 1200 μL con terreno di crescita. Etichettare questo tubo come Densità 1 (Figura 3). Eseguire la diluizione seriale per creare sospensioni cellulari a densità di semina multipla.Dalla densità 1 preparata nel passaggio 4.1.1, preparare altre tre densità di sospensione cellulare attraverso la diluizione seriale come da Figura 3. Diluire ogni densità di un fattore 2 nel terreno di coltura. Innanzitutto, aggiungere il volume finale richiesto (600 μL dall’esempio precedente) di terreno di crescita a tre provette da centrifuga sterili da 2 mL o 15 mL. Trasferire metà della densità 1 (600 μL) in una delle provette, mescolando accuratamente la sospensione cellulare con il mezzo da diluire. Etichettare questo tubo come Densità 2. Trasferire metà della densità 2 (600 μL) nella provetta successiva, mescolando accuratamente la sospensione cellulare con il mezzo da diluire. Etichettare questo tubo come Densità 3. Trasferire metà della densità 3 (600 μL) nella provetta successiva, mescolando accuratamente la sospensione cellulare con il mezzo da diluire. Etichettare questo tubo come Densità 4. Scartare 600 μL dalla densità 4 in modo che tutte e quattro le preparazioni abbiano un volume finale di 600 μL. Come controllo negativo, aggiungere 600 μL di terreno di coltura solo a una provetta da centrifuga sterile da 2 mL. Vedere la Figura 3 per uno schema del processo di diluizione seriale. Figura 3: Diluizione seriale del materiale cellulare per preparare 4 sospensioni per 4 diverse densità di semina dell’impalcatura. (A) I numeri possono essere regolati per adattarsi alla densità di semina desiderata per scaffold e (B) moltiplicati per il numero totale di scaffold per densità, con ogni scaffold che riceve 20 μL di sospensione cellulare. In questo esempio, la densità 1 richiede 6 × 105 celle per scaffold, equivalenti a 1,8 × 107 celle in 600 μL per 30 scaffold. Questo numero viene raddoppiato per iniziare la diluizione seriale, poiché 600 μL vengono quindi trasferiti e diluiti in 600 μL di terreno di coltura nella provetta successiva. Questo processo continua fino a quando non ci sono 4 sospensioni cellulari con un fattore di 2 tra ciascuna. Un controllo negativo viene effettuato aggiungendo 600 μL di mezzo solo a una provetta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Aggiunta di sospensioni cellulari agli scaffoldNOTA: Rimuovere gli scaffold (conservati in PBS) dal frigorifero e lasciarli a temperatura ambiente (RT) prima di aggiungere le celle.Portare gli scaffold in PBS nella cappa a flusso laminare. Utilizzando una pinzetta sterile, posizionare gli scaffold in piastre non aderenti da 24 pozzetti con uno scaffold per pozzetto (Figura 1C). Sollevare delicatamente le impalcature dagli angoli e premerle leggermente contro il lato del contenitore per rimuovere il PBS in eccesso. Aggiungere le impalcature al centro dei pozzetti con la pelle rivolta verso il basso (il lato dello strato lucido dell’impalcatura, rivolto verso il basso nelle piastre di plastica a 24 pozzetti). Etichettare le piastre a 24 pozzetti con i dettagli della linea cellulare, i parametri rilevanti (ad esempio, la densità di semina) e i punti temporali. Lavorare con una densità di semina cellulare alla volta, mantenendo le densità rimanenti nell’incubatore a 37 °C fino al momento dell’uso. Nella cappa a flusso laminare, utilizzare una pipetta P20 e puntali sterili per aggiungere delicatamente 20 μL della sospensione cellulare pertinente al centro di ciascuna impalcatura (Figura 1D). Tenere le cellule accuratamente in sospensione mescolando bene mentre si aggiungono le cellule alle impalcature. Assicurarsi che la sospensione rimanga sopra l’impalcatura e non scivoli sulla base del pozzetto, poiché ciò non consentirà l’attacco delle celle all’impalcatura. Una volta aggiunte le cellule, incubare le piastre per 3-5 ore (37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità) per consentire alla maggior parte delle cellule di attaccarsi. Dopo l’incubazione, aggiungere lentamente e delicatamente 1 mL di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto (Figura 1E). Utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere il terreno per consentire un movimento più lento e controllato, evitando lo spostamento degli scaffold. Se si lavora con un numero molto elevato di scaffold, utilizzare una pipetta da 10 ml con la pistola per pipette impostata su “drop” e “low”. Incubare le piastre a 24 pozzetti per una notte (37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità). Manutenzione delle celle sugli scaffoldDopo le prime 24 ore di attacco cellulare (Giorno 1), trasferire gli scaffold seminati in nuove piastre a 24 pozzetti non aderenti e aggiungere 1-2 ml di terreno di coltura fresco.NOTA: Questo passaggio rimuove le cellule che sono cadute sul fondo delle piastre di plastica a 24 pozzetti piuttosto che consentire loro di crescere sugli scaffold. Le repliche dell’impalcatura designate come Giorno 1 verranno rimosse dopo 24 ore, come discusso nella sezione 5; Pertanto, la manutenzione non si applica a queste impalcature. Monitorare gli scaffold inizialmente ogni 2-3 giorni per un cambiamento di colore del mezzo di crescita. Man mano che il tempo passa e le cellule proliferano all’interno degli scaffold, nutri le cellule più frequentemente. Utilizzando una pistola per pipette da 10 mL, in modalità lenta, rimuovere 1 mL del terreno esausto e gettarlo. Se si eseguono esperimenti che richiedono un terreno condizionato, raccogliere il terreno esaurito delle repliche biologiche in una provetta da centrifuga da 15 mL, centrifugare a 340 × g per 2 minuti per pellettare i detriti cellulari, trasferire il surnatante in una provetta fresca e conservare a -80 °C. Aggiungere delicatamente 2 mL di terreno di coltura preriscaldato agli scaffold, utilizzando nuovamente la funzione di gocciolamento sulla pipetta, e riportare la piastra a 24 pozzetti nell’incubatore (37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità). Ripetere ogni volta che il terreno viene esaurito per la durata del periodo di crescita desiderato. 5. Recupero e applicazioni dello scaffold NOTA: In ogni momento, diverse applicazioni possono essere utilizzate per monitorare la crescita cellulare sugli scaffold o valutare i profili di espressione genica e proteica. Le condizioni di recupero dello scaffold dipenderanno dall’analisi da eseguire, con più metodi di recupero descritti nelle sottosezioni seguenti e dimostrati nella Figura 4. Valutazione della vitalità cellulare all’interno di scaffoldSterilizzare il reagente appropriato per il saggio di vitalità cellulare filtrando attraverso un filtro sterile da 0,2 μm in una provetta da centrifuga nella cappa a flusso laminare. Preriscaldare questa soluzione sterile insieme al terreno di coltura completo e al PBS sterile in un bagno d’acqua a 37 °C. Nella cappa a flusso laminare, utilizzare pinzette sterili per trasferire gli scaffold da analizzare su una nuova piastra a 24 pozzetti. Etichettare la targhetta con tutti i dettagli pertinenti.NOTA: Eseguire l’analisi in triplice copia. Aggiungere 900 μL del terreno di crescita preriscaldato a ciascun pozzetto, seguiti da 100 μL del reagente sterile per la vitalità cellulare. Includere un controllo negativo aggiungendo 900 μL di terreno e 100 μL di reagente sterile di vitalità cellulare in un pozzetto senza scaffold. Riposizionare il coperchio sulla piastra e far oscillare delicatamente la piastra per ~3 minuti per distribuire uniformemente il reagente di vitalità cellulare diluito in tutto il pozzetto. Incubare la piastra a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità.NOTA: I tempi di incubazione dovranno essere ottimizzati per ogni linea cellulare; Fare riferimento alle linee guida del produttore. Per le linee cellulari di neuroblastoma, l’incubazione di 4-6 ore sembra ottimale. Dopo l’incubazione, rimuovere la piastra dall’incubatrice e scuoterla delicatamente per alcuni secondi. Nella cappa a flusso laminare, aprire una nuova piastra traslucida a 96 pozzetti. Da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti, trasferire il terreno incubato e il reagente in tre pozzetti della piastra a 96 pozzetti con 100 μL per pozzetto, ottenendo triplicati tecnici.NOTA: Questo trasferimento lascerà 700 μL nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti. Coprire la piastra a 96 pozzetti con un foglio di alluminio per proteggere il reagente di vitalità cellulare dalla luce. Rimuovere ed eliminare i restanti 700 μL del contenuto del pozzetto da ciascuna impalcatura nella piastra a 24 pozzetti. Lavare ogni impalcatura due volte con 1 mL di PBS sterile.NOTA: Tutto il colore non verrà rimosso dalle impalcature. Questi scaffold possono quindi essere utilizzati per ulteriori applicazioni, ad esempio per la quantificazione del DNA, inserendoli in 1 mL di Triton X-100 all’1% in una soluzione di bicarbonato di sodio (NaHCO3 0,1 M) e conservandoli a -80 °C (vedere paragrafo 5.2, Figura 4B). Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dalla cappa a flusso laminare e misurare l’assorbanza di ciascun pozzetto a lunghezze d’onda di 570 nm e 600 nm utilizzando un lettore per micropiastre. Registrare i valori di assorbanza a entrambe le lunghezze d’onda e seguire le istruzioni del produttore per calcolare la riduzione percentuale del reagente di vitalità cellulare da parte delle cellule. Rappresentare graficamente e analizzare statisticamente i risultati della vitalità cellulare utilizzando un software appropriato. Immettere valori biologici triplicati per produrre barre di errore e indicare la variabilità del saggio. Per esaminare i cambiamenti nella vitalità cellulare nell’arco di tempo sperimentale, eseguire un test di analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con confronti multipli delle medie utilizzando un software biostatistico appropriato. Indicare differenze significative tra i punti temporali sui grafici come ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) e **** (P≤0,0001). Figura 4: Recupero di scaffold per analisi diverse in ogni punto temporale. (A) Vengono recuperate tre repliche di scaffold per l’analisi della vitalità cellulare. (B) Questi scaffold possono quindi essere lavati in PBS, posti in Triton X-100 all’1% in NaHCO3 0,1 M e conservati a -80 °C per la quantificazione del DNA. (C) Altre tre repliche vengono fissate in PFA al 10% per 15 minuti, neutralizzate in PBS e conservate a 4 °C per la colorazione istologica e l’imaging. (D) Infine, 3 repliche vengono aggiunte a un reagente di lisi cellulare a base di fenolo/guanidina e conservate a -20 °C per l’analisi dell’espressione genica. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfati; PFA = paraformaldeide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Quantificazione del DNA dalle cellule negli scaffoldNOTA: Come accennato nella nota dopo il passaggio 5.1.7, il recupero degli scaffold per la quantificazione del DNA comporta il posizionamento degli scaffold in provette da centrifuga da 2 mL contenenti 1 mL di Triton X-100 all’1% in una soluzione di NaHCO3 0,1 M seguita da conservazione a -80 °C. Prima che l’analisi del DNA possa essere eseguita, le cellule devono essere sottoposte a tre cicli di congelamento-scongelamento per lisare le cellule di neuroblastoma in modo appropriato e rilasciare il DNA per la quantificazione.Rimuovere i campioni precedentemente conservati in Triton X-100 da -80 °C. Lasciare i campioni a RT per 1-3 ore o fino allo scongelamento. Agitare i campioni per 10-20 secondi e riposizionare i campioni a -80 °C per 18-24 ore o fino a completo congelamento. Ripetere questo processo per un totale di tre cicli di gelo-scongelamento. Per massimizzare la resa del DNA, utilizzare un lisatore tissutale per distruggere le cellule negli scaffold.Posizionare una perlina di metallo nella provetta da centrifuga da 2 mL contenente un’impalcatura in Triton X-100 e posizionare la provetta all’interno dell’adattatore per agitare il campione a 50 oscillazioni al secondo per 2-3 minuti.NOTA: Utilizzare provette da centrifuga a fondo tondo poiché la perlina metallica potrebbe depositarsi in una provetta a fondo conico. Quantificare il DNA nella soluzione Triton X-100 applicando un colorante fluorescente di DNA a doppio filamento (dsDNA) e misurare l’emissione utilizzando un lettore di micropiastre. Fare riferimento alle linee guida del produttore; diluire i campioni in modo appropriato nel tampone di acido tris-etilendiammina tetraacetico (TE) per preparare 8 standard di dsDNA mediante diluizione seriale nel tampone TE (Figura 5). Nelle piastre nere opache a 96 pozzetti, aggiungere 100 μL di ogni standard o campione ai pozzetti in triplice copia. Diluire il colorante fluorescente di dsDNA 200 volte nel tampone TE e aggiungere 100 μL a ciascun standard/campione utilizzando una pipetta multicanale. Coprire la piastra con carta stagnola e incubare a RT per 5 min. Misurare e registrare la fluorescenza di ciascun pozzetto a 520 nm. Seguire le linee guida del produttore per calcolare la concentrazione di DNA in ciascun campione.NOTA: Se la concentrazione media di DNA per cellula è nota per la linea cellulare utilizzata, i valori di concentrazione del DNA possono essere convertiti in numeri di cellule utilizzando l’equazione (4).(4) Rappresentare graficamente e analizzare statisticamente i risultati della quantificazione del DNA utilizzando un software appropriato. Immettere valori biologici triplicati per produrre barre di errore e indicare la variabilità del saggio. Per esaminare le variazioni della concentrazione di DNA/numero di cellule nel periodo di tempo sperimentale, eseguire un test ANOVA unidirezionale con confronti multipli delle medie utilizzando un software biostatistico appropriato. Indicare differenze significative tra i punti temporali sui grafici come ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) e **** (P≤0,0001). Figura 5: Preparazione di otto standard di DNA per la generazione di una curva standard. Una soluzione madre di λDNA viene fornita a 100 μg/mL. Questo viene diluito 50 volte in tampone TE per creare lo standard A a 2000 ng/mL; 400 μL di A vengono quindi trasferiti nella provetta B, contenente 400 μL di tampone TE; 400 μL di B vengono quindi trasferiti e diluiti 2 volte in C, e così via fino a G. Lo standard H è composto solo da tampone TE e quindi ha una concentrazione di DNA di 0 ng/mL. Abbreviazione: TE = Tris-EDTA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Preparazione di scaffold per la colorazione istologicaNOTA: Gli scaffold possono essere fissati e colorati per scopi di microscopia e imaging sia come scaffold interi per l’immunofluorescenza (IF) che come fette fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE) per la colorazione istologica o l’immunoistochimica (IHC). Ciò consente la valutazione qualitativa della penetrazione e della distribuzione cellulare all’interno degli scaffold e può essere utilizzato per valutare l’espressione delle proteine.Preparare una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 10% in PBS. Assicurarsi che vi sia una soluzione sufficiente per un volume finale di 500 μL per scaffold. Preriscaldare questa soluzione a 37 °C e aggiungere 500 μL alle provette da centrifuga da 2 mL etichettate per il recupero dello scaffold. Rimuovere gli scaffold dalle piastre a 24 pozzetti non aderenti (passaggio 4.4.4) e posizionarli nella cappa a flusso laminare. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire gli scaffold nelle provette da centrifuga etichettate contenenti il 10% di PFA. Lasciare fissare gli scaffold nella soluzione di PFA per 15 minuti. Neutralizzare il PFA aggiungendo 500 μL di PBS a ciascuna provetta e conservare a 4 °C. Per preparare gli scaffold per l’Automatic Tissue Processor, rimuoverli da 4 °C e posizionarli con una pinzetta in cassette di plastica etichettate a matita con tutti i dettagli pertinenti. Collocare tutte le cassette nel contenitore metallico del processatore di tessuti. Iniziare il protocollo in 12 fasi sul processatore di tessuti per riparare, disidratare, eliminare le impalcature e infiltrarle con paraffina durante la notte. Raccogliere le cassette contenenti i campioni processati. Successivamente, incorporare gli scaffold in blocchi di cera di paraffina per consentire la microtomia degli scaffold in fette molto sottili per la colorazione.NOTA: È particolarmente importante considerare l’orientamento delle impalcature quando le si rimuove dalle cassette e le si incorpora nella cera, poiché ciò influirà sull’angolazione con cui vengono scattate le immagini. Questo è importante quando si valuta l’infiltrazione cellulare negli scaffold. Accendere l’incastro di cera e la piastra fredda; Sollevare il coperchio per controllare il livello della cera. Rabboccare se necessario. Lavorando con un campione alla volta, aprire la cassetta, rimuovere l’impalcatura e centrarla nello stampo di plastica. Versare la cera calda sul campione, assicurandosi di mantenere il corretto orientamento e regolando con pinzette calde, se necessario, prima che la cera si solidifichi. Versare altra cera per riempire lo stampo. Posiziona il coperchio della cassetta etichettato sopra lo stampo di plastica e aggiungi la cera sopra. Posizionare lo stampo sulla piastra fredda per solidificare la cera. Conservare per una notte a 4 °C per garantire che la cera di paraffina sia completamente solidificata prima della microtomia. Per prepararsi alla microtomia, accendere un bagnomaria a 35 °C, la piastra di asciugatura e il microtomo. Inserire una lama nel supporto e serrare la leva per fissarla. Impostare il rifilo e lo spessore della sezione, generalmente 5 mm per le sezioni di ponteggio. Rimuovere l’impalcatura FFPE dallo stampo, fissarla nel supporto sulla parte anteriore del microtomo e tagliare con cura la cera in eccesso attorno ai bordi del campione prima di tagliare le sezioni. Inizia a tagliare il blocco di cera ruotando la leva del microtomo, assicurando un movimento fluido. Raccogliere le sezioni a nastro, circa 3 sezioni di impalcatura alla volta, e posizionarle delicatamente nel bagnomaria a 35 °C per rimuovere le rughe. Separare delicatamente le sezioni mentre si trovano a bagnomaria usando una pinzetta. Utilizzando vetrini da microscopio rivestiti in polisseno, sollevare ogni sezione dal bagnomaria in modo che si trovi al centro del vetrino. Etichetta ogni diapositiva con una matita. Posizionare i vetrini sulla piastra di essiccazione o in un forno di essiccazione a 60 °C. Una volta essiccati, conservarli a 4 °C e procedere con la colorazione istologica o IHC richiesta. Recupero di scaffold per l’analisi dell’espressione genicaRimuovere gli scaffold dalle piastre a 24 pozzetti non aderenti dall’incubatore (passaggio 4.4.4) e posizionarli nella cappa a flusso laminare. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire gli scaffold in provette da centrifuga da 2 mL fresche etichettate. In una cappa aspirante, aggiungere 1 mL di un reagente di lisi cellulare a base di fenolo/guanidina a ciascuna provetta per lisare le cellule negli scaffold e consentire il recupero di RNA di alta qualità. Conservare le provette a -20 °C fino al momento di eseguire l’estrazione dell’RNA utilizzando un kit appropriato. Utilizzando una reazione a catena della polimerasi quantitativa standard a trascrizione inversa (RT-qPCR)17, valutare l’espressione genica nelle cellule negli scaffold.