מודל ביומימטי תלת מימדי במבחנה של נוירובלסטומה באמצעות פיגומים מבוססי קולגן

1. תכנון ניסיוני הערה: מספר הפיגומים והתאים הדרושים לכל ניסוי יהיה תלוי בקנה המידה של הניסוי וניתן לחשב אותו באמצעות הכלים בחלק זה על תכנון הניסוי. מספר הפיגומים הנדרשלקבוע את ציר הזמן הכולל של הניסוי ואת מרווחי ההערכה עבור שינויים בביולוגיה של התא (למשל, גדילת תאים ומטבוליזם).הערה: לדוגמה, מסגרת הזמן של הניסוי היא 14 יום, עם הערכה של צמיחת תאים כל 7 ימים. לפיכך, נקודות הזמן הניסיוניות הן ימים 1, 7, 14 הנותנות בסך הכל 3 נקודות זמן. לאחר מכן, החליטו על מספר היישומים הניסיוניים שייושמו בכל נקודת זמן. נסה להשלים את אותם ניתוחים בכל נקודת זמן כדי לעקוב אחר השינויים.הערה: ניתוחים אופייניים של צמיחת תאים על פיגומים כוללים בדיקות כדאיות תאים, כימות DNA, צביעה והדמיה היסטולוגית וניתוח ביטוי גנים. אלה יידונו עוד בסעיף 5. החלט מתי להשתמש באותו פיגום עבור יישומים מרובים במורד הזרם, למשל, לאחר הערכת כדאיות התא באמצעות בדיקה מתאימה, השתמש שוב בפיגום לבידוד DNA/RNA (נדון ב- 5.1.11). שמור מינימום של 3 עותקים ביולוגיים עבור כל יישום, למשל, 3 פיגומים עבור כדאיות התא וכימות DNA, 3 עבור היסטולוגיה, ו 3 עבור ניתוח ביטוי גנים. מכיוון שזה שווה ל-9 פיגומים לנקודת זמן, תכננו להשתמש ב-27 פיגומים עבור 3 נקודות זמן. לבסוף, הכפל מספר זה במספר הפרמטרים או התנאים הניסיוניים (למשל, הערכת קווי תאים מרובים, צפיפות זריעה ראשונית, הרכבי פיגומים).הערה: בפרוטוקול זה, 4 צפיפויות זריעה ראשוניות שונות הוערכו עבור קו תאים אחד, וכתוצאה מכך נדרשו 108 (27 פיגומים x 4 תנאים) פיגומים. כדי לקחת בחשבון טעויות אנוש ולתת כיסוי נוסף, הוסף ~ 10% למספר זה, למשל, אם נדרשים 108 פיגומים, הכינו 120 פיגומים. מספר התאים הנדרשיםהערה: נפח 20 μL של תרחיף תאים מומלץ לזריעת תאים על פיגום גלילי (קוטר 6 מ”מ, גובה 4 מ”מ) ביום 0. מספר התאים לכל 20 מיקרוליטר זה של תרחיף התא מותאם בהתאם לתכנון הניסוי, המחושב בסעיף 1.1. צפיפות זריעה התחלתית נפוצה היא 2 × 105 תאים לכל 20 μL, המשמשת כדוגמה לפרוטוקול להלן.כדי לחשב את כמות התאים הכוללת הנדרשת לניסוי, הכפל את 2 × 105 התאים הראשונים לכל 20 מיקרוליטר במספר הפיגומים הנדרשים.הערה: לדוגמה, 30 פיגומים כפול 20 μL נותן נפח כולל של 600 μL. אם כל פיגום דורש 2 × 10 5 תאים, 600 μL של תרחיף מכיל סך של 6 × 10 6 תאים (2 × 105 × 30), נותן דרישה סופית של 6 × 106 תאים ב 600 μL. מספר הפרמטרים הניסיוניים יכתיב את מספר התאים הכולל הנדרש. פרוטוקול זה, אם כן, מתאר תרבית תאים באמצעות צלוחיות תרבית תאים רב שכבתיות, אשר יכול להתמודד עם אותו מספר תאים כמו 10 מסורתי 175 ס”מ2 צלוחיות. 2. הכנת פיגומים על בסיס קולגן הערה: פיגומים גליליים Coll-I-nHA ו- Coll-I-GAG (קוטר 6 מ”מ, גובה 4 מ”מ) מוכנים בשיטות שנקבעו 15,21,27. לאחר הצלבה כימית לפי שיטות שפורסמו בעבר17, יש להשתמש בפיגומים תוך שבוע. לאחר ייצור הפיגומים בעלי התכונות המכאניות הרצויות, יש לוודא שהפיגומים רוויים במים מלאים ונשטפים היטב במי מלח חוצצי פוספט (PBS).הערה: זה בדרך כלל לוקח ~ 12 שעות לאחר crosslinking של פיגומים והוא יכול להתבצע במיכלי פסולת תרבית רקמה 100 מ”ל ב 4 ° C, עם מקסימום של 50 פיגומים לכל מיכל ו 2 מ”ל של PBS לכל פיגום. אחסנו את הפיגומים ב-PBS בטמפרטורה של 4°C עד שהם מוכנים לשימוש. 3. להפיץ תאי נוירובלסטומה בבקבוק תרבית תאים רב שכבתי הערה: צפיפות הזריעה האופטימלית עבור הבקבוק הרב-שכבתי תשתנה. עבור הבקבוק המשמש בניסוי זה, הצפיפות האופטימלית לפי הוראות היצרן היא 1 × 107 תאים. לפני זריעת הצלוחית הרב-שכבתית, יש להפיץ תאים לצפיפות של 1 × 107 תאים ומעלה בבקבוק תרבית רקמה מתאים (למשל, צלוחיות תרבית רקמה T175 ס”מ2 ). כדי לזרוע תאים לתוך הבקבוק הרב-שכבתי (סעיף 3.1), לגדל אותם עד 70-80% נפגשים, לקצור ולספור את מספר התאים למ”ל, תוך התייחסות לשלבים 3.2.16-3.2.20 לביצוע ספירת התאים. לאחר ספירת תרחיף התא, המשך מיד לזריעת הצלוחית הרב-שכבתית. עבודת תרבית תאים חייבת להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית כדי לשמור על סטריליות. זריעת בקבוק תרבית התאים הרב-שכבתיחימום מראש של 550 מ”ל של מדיום גידול מלא (משתנה בהתאם לקו התאים בשימוש) ו -100 מ”ל של PBS סטרילי באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. באמצעות תרחיף התא שנקטף, חשב את הנפח הנדרש של תרחיף התא הדרוש להשגת צפיפות הזריעה האופטימלית של 1 × 107 תאים באמצעות משוואה (1), כאשר WANT מתייחס למספר התאים הדרושים לזריעת הבקבוק הרב-שכבתי, ו- HAVE מתייחס למספר התאים / מ”ל בתרחיף התא:(1)לדוגמה, הוסף את הנפח הנדרש של תרחיף התא ל -100 מ”ל של מדיום הגידול המחומם מראש. קחו בקבוק רב-שכבתי חדש במכסה המנוע, הסירו את המכסה והחזיקו את הבקבוק בזווית של 60°. לאט לאט פיפטה כל 100 מ”ל של התא מתלה לתוך הצלוחית, במורד הצד הזוויתי של הצוואר. מכסים את הבקבוק ומניחים אותו על צידו כדי לאפשר לתאים להתפזר בין השכבות באופן שווה. בזווית של 60°, הוסיפו 400 מ”ל של מצע הגידול שחומם מראש לבקבוק הרב-שכבתי על ידי מזיגה איטית או פיפטציה במורד הצד הזוויתי של הצוואר. אם הצוואר מתמלא, החזירו את הבקבוק למצב זקוף, או סגרו את הבקבוק והניחו אותו על צידו לפני שתחזרו למזיגה.הערה: שפכו לאט כדי למנוע היווצרות מוגזמת של בועות. הקש בעדינות על הבקבוק במצב זקוף כדי לאפשר לכל הבועות לעלות למעלה והסר אותן עם פיפטה של 10 מ”ל. ודא שהבקבוק מלא בחוט התחתון של הצוואר; הוסף עוד מדיום, במידת הצורך, כדי להשיג זאת. מכסים את הבקבוק הרב-שכבתי ודגרים עליו כשהצוואר הזוויתי פונה כלפי מטה ב-37°C, 5%CO2 ו-95% לחות. בדוק את הצמיחה כל 2-3 ימים עבור confluency. כדי לבדוק את המפגש של שתי השכבות התחתונות של הצלוחית הרב-שכבתית, צפו בהן תחת עדשה אובייקטיבית 4x של מיקרוסקופ הפוך.הערה: כאשר זרע עם 1 × 107 תאי נוירובלסטומה, בקבוק 10 שכבות ייקח בדרך כלל שבוע כדי להיות confluent – אם כי זה עשוי להשתנות בהתאם לקו התאים בשימוש. תחזוקה שוטפת של תאים בבקבוק הרב שכבתיחימום מראש של 550 מ”ל של מדיום גידול מלא (משתנה בהתאם לקו התאים בשימוש), 50-100 מ”ל של טריפסין, ו 300 מ”ל של PBS סטרילי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בדוק את בקבוק רב שכבתי עבור 70-80% confluency. מניחים את הבקבוק הרב שכבתי במכסה מנוע זרימה למינרית ומשליכים את המדיום המשומש מהבקבוק על ידי מזיגה. בתחילה, להטות את הבקבוק כך המדיום הוא שפך על סכר האוויר לתוך מיכל פסולת. בזמן המזיגה, סובבו את הבקבוק ב-180 מעלות עד שהתווך זורם במורד הצוואר הזוויתי של הצלוחית. סובבו את הבקבוק קדימה ואחורה לאורך ציר זה כדי לסלק את שאריות הנוזלים. שטפו את התאים על ידי הוספת 100 מ”ל של PBS סטרילי שחומם מראש באיטיות במורד הצוואר הזוויתי. מכסים את הצלוחית, מניחים אותה על צדה כדי לאפשר פיזור אחיד של PBS, ומסובבים את הבקבוק קדימה ואחורה כדי לשטוף את התאים. יש להשליך את שטיפת PBS באותו אופן כמו 3.2.3. חזרו על שלבי הכביסה. לדלל 50 מ”ל של טריפסין שחומם מראש ב 50 מ”ל של PBS סטרילי שחומם מראש. הוסיפו 100 מ”ל של תמיסת טריפסין מדוללת לצלוחית הרב-שכבתית, למכסה והניחו את הבקבוק על צידו כדי לאפשר פיזור אחיד של הטריפסין. אם קו התא הוא דבק מאוד, להשתמש 100 מ”ל של טריפסין לא מדולל. יש לדגור על הבקבוק במשך 2-5 דקות בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-95% לחות, תוך ניטור ניתוק התאים מתחת למיקרוסקופ. במידת הצורך, הקש על הבקבוק בחוזקה כדי לסייע בניתוק או החזיר אותו לאינקובטור למשך דקה נוספת. מניחים את הבקבוק הרב שכבתי במכסה מנוע זרימה למינרית ומנטרלים את הטריפסין עם 100 מ”ל של מדיום צמיחה. מכסים את הצלוחית, מניחים אותה על צדה, ומתנדנדים קדימה ואחורה כדי להבטיח נטרול מלא. יוצקים את מתלה התא המנוטרל לתוך צינורות צנטריפוגות חרוטיות 4 x 50 מ”ל.הערה: אם נדרש קציר תאים מלא, שטפו שוב את הבקבוק הרב-שכבתי עם 100 מ”ל של PBS סטרילי ושפכו אותו לצינורות צנטריפוגות בגודל 2 x 50 מ”ל. צנטריפוגה את תרחיף התא בצינורות צנטריפוגות 50 מ”ל ב 340 × גרם במשך 3-4 דקות כדי לגלול את התאים. מחזירים את צינורות הצנטריפוגות למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ומשליכים בזהירות כמה שיותר סופרנאטנט מכל כדור.הערה: הגלולה תהיה גדולה ורופפת יחסית ולכן ניתן לשבש אותה בקלות. הוסף 1-5 מ”ל של מדיום גידול לכל גלולה והשהה אותו מחדש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. אגרו יחד את 4 הכדוריות התלויות בצינור צנטריפוגה אחד של 50 מ”ל, ערבבו אותן היטב עם הפיפטה, ושימו לב לנפח הכולל. בצע דילול מתאים של תרחיף התא לספירת תאים כך שכל ריבוע חיצוני על ההמוציטומטר יכיל 30-100 תאים.הערה: דילול התחלתי מתאים הוא 1:100; לשם כך, פיפטה 10 μL של השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי טרי 15 מ”ל לדלל אותו עם 990 μL של PBS סטרילי. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב היטב. מניחים צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ”ל המכיל את מלאי התאים באינקובטור בזמן הספירה. אם ניקח המוציטומטר נקי, הניחו כיסוי נקי על הרשת, כפי שמוצג באיור 2. פיפטה 10 μL של תרחיף התא המדולל לתוך תא hemocytometer. אם התא מתמלא לפני הוצאת כל 10 μL, הפסיקו את הפיפט. מקם את ההמוציטומטר תחת המטרה 4x של מיקרוסקופ אור. התאם את המיקוד הגס והעדין כדי להציג את התאים באופן חזותי. ספרו את מספר התאים בארבעת הריבועים הפינתיים החיצוניים של התא כפי שמודגש באיור 2. הוסף את ארבע הספירות וחלק ב- 4 כדי לחשב את ממוצע התאים לריבוע. איור 2: ספירת תאים באמצעות המוציטומטר. עשרה מיקרוליטרים של תרחיף תאים מתווספים להמוציטומטר שמתחת לכיסוי. לאחר מכן החדר ממוקם מתחת לעדשה אובייקטיבית 4x של מיקרוסקופ, ומספר התאים בארבע הפינות החיצוניות של הרשת נספרים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הכפל את הספירה הממוצעת בגורם הדילול (למשל, 100) והכפיל מספר זה ב- 10,000 כדי לקבל את מספר התאים למ”ל באמצעות משוואה (2). (2) חשב את מספר התאים הכולל בתמיסת המניות על ידי הכפלה בנפח הכולל של מלאי התאים (לדוגמה, אם 4 הכדוריות המרחפות שאוגדו יצרו תמיסה של 20 מ”ל, הכפל תאים/מ”ל ב- 20). כדי לשמור על הבקבוק הרב-שכבתי, השתמש במשוואה (1) המתוארת בשלב 3.1.2 כדי לחשב את נפח מלאי התאים הדרוש כדי לזרוע 1 × 107 תאים בחזרה לתוך הבקבוק ולבצע שלבים 3.1.3-3.1.6 כדי לזרוע מחדש את הצלוחית. אם מוכנים לזרוע את הפיגומים, המשך לסעיף הבא. 4. זרע תאי נוירובלסטומה על פיגומים הכנת השעיית תאי מלאיהערה: פרוטוקול זה יתאר את השלבים ליצירת ארבע צפיפויות זריעה שונות של תאי נוירובלסטומה, עם מקדם כפל של 2 בין כל צפיפות. דילול סדרתי ישמש אפוא ליצירת שלושה מתלי תאים נוספים מהשעיית המלאי. עבודת תרבית תאים חייבת להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית כדי לשמור על סטריליות.השתמש במשוואה (3) כדי לחשב את נפח התאים הדרוש ממספר התאים הכולל בבקבוק הרב-שכבתי (נספר בסעיף 3.2.19) כדי להכין את צפיפות הזריעה הראשונה או את השעיית מלאי התא.(3)הערה: לדוגמה, אם צפיפות הזריעה הגבוהה ביותר היא 6 × 10 5 תאים לכל פיגום הנדרשים עבור 30 פיגומים, כאשר כל פיגום מקבל 20 μL של תרחיף תאים, תרחיף תאי המלאי ידרוש 1.8 × 107 תאים (6 × 105 תאים × 30 פיגומים) בנפח כולל של 600 μL (20 μL × 30 פיגומים).מכיוון שיבוצע דילול סדרתי מהכנה זו, יש להכפיל מספרים אלה, כלומר 3.6 × 107 תאים בנפח כולל של 1200 μL. כדי להמיר זאת ל- WANT בתאים לכל מ”ל; לחלק 3.6 × 10 7 על ידי 1200 μL ולהכפיל על ידי 1000 μL, נותן 3 × 107 תאים לכל מ”ל.​ הוסף את נפח מלאי התאים הנדרש לצינור צנטריפוגה סטרילי של 2 מ”ל או 15 מ”ל והבא לנפח סופי של 1200 מיקרוליטר עם מדיום גידול. תייגו את הצינור הזה כצפיפות 1 (איור 3). בצע דילול טורי כדי ליצור תרחיפים מרובים של תאים בצפיפות זריעה.מצפיפות 1 שהוכנה בשלב 4.1.1, הכינו שלוש צפיפויות נוספות של תרחיף תאים באמצעות דילול סדרתי לפי איור 3. לדלל כל צפיפות בפקטור של 2 בתווך הגידול. ראשית, הוסף את הנפח הסופי הנדרש (600 מיקרוליטר מהדוגמה הקודמת) של מדיום גידול לשלושה צינורות צנטריפוגות סטריליים של 2 מ”ל או 15 מ”ל. מעבירים מחצית צפיפות 1 (600 μL) לאחד הצינורות, מערבבים היטב את תרחיף התא עם המדיום לדלל. תייג צינור זה כצפיפות 2. מעבירים מחצית מצפיפות 2 (600 μL) לצינור הבא, מערבבים היטב את תרחיף התא עם המדיום לדלל. תייג צינור זה כצפיפות 3. מעבירים מחצית צפיפות 3 (600 μL) לצינור הבא, מערבבים היטב את תרחיף התא עם המדיום לדלל. תייג צינור זה כצפיפות 4. יש להשליך 600 μL מצפיפות 4 כך שלכל ארבעת התכשירים יהיה נפח סופי של 600 μL. כבקרה שלילית, הוסף 600 μL של מדיום גידול רק לצינור צנטריפוגה סטרילי של 2 מ”ל. ראו איור 3 לשרטוט של תהליך הדילול הסדרתי. איור 3: דילול סדרתי של מלאי תאים להכנת 4 מתלים עבור 4 צפיפויות שונות של זריעת פיגומים. (A) ניתן לכוונן את המספרים כך שיתאימו לצפיפות הזריעה הרצויה לכל פיגום, ו-(B) להכפיל את המספר הכולל של פיגומים לכל צפיפות, כאשר כל פיגום מקבל 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים. בדוגמה זו, צפיפות 1 דורשת 6 × 105 תאים לכל פיגום, שווה ערך ל- 1.8 × 107 תאים ב- 600 μL עבור 30 פיגומים. מספר זה מוכפל כדי להתחיל את הדילול הסדרתי, כאשר 600 μL מועבר ומדולל ב 600 μL של מדיום גידול בצינור הבא. תהליך זה נמשך עד שיש 4 תאים מתלים עם פקטור של 2 בין כל אחד. בקרה שלילית נעשית על ידי הוספת 600 μL של בינוני רק לצינור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הוספת מתלי תאים לפיגומיםהערה: הסר את הפיגומים (המאוחסנים ב- PBS) מהמקרר ואפשר להם להגיע לטמפרטורת החדר (RT) לפני הוספת התאים.הכניסו את הפיגומים ב-PBS למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. בעזרת פינצטה סטרילית, הניחו את הפיגומים בלוחות לא דבוקים של 24 בארות עם פיגום אחד לכל באר (איור 1C). הרימו בעדינות את הפיגומים בפינותיהם ולחצו אותם קלות לצד המיכל כדי להסיר עודפי PBS. מוסיפים את הפיגומים למרכז הבארות בצד העור כלפי מטה (צד השכבה המבריק של הפיגומים, הפונה מטה אל לוחות 24 בארות הפלסטיק). תייגו את לוחות 24 הקידוחים עם פרטים על קו התא, פרמטרים רלוונטיים (למשל, צפיפות זריעה) ונקודות זמן. עבוד עם צפיפות זריעה של תא אחד בכל פעם, תוך שמירה על הצפיפויות הנותרות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, השתמשו בפיפטת P20 ובקצוות סטריליים כדי להוסיף בעדינות 20 μL של מתלה התאים הרלוונטי למרכז כל פיגום (איור 1D). שמור היטב את התאים בתרחיף על ידי ערבוב היטב תוך הוספת התאים לפיגומים. ודא כי המתלה נשאר על גבי הפיגום ולא מחליק על בסיס הבאר, שכן זה לא יאפשר חיבור תאים לפיגומים. לאחר הוספת התאים, דגרו על הלוחות במשך 3-5 שעות (37°C, 5% CO2 ו-95% לחות) כדי לאפשר לרוב התאים להיחבר. לאחר הדגירה, הוסיפו לאט ובעדינות 1 מ”ל של מצע גידול שחומם מראש לכל באר (איור 1E). השתמש פיפטה P1000 כדי להוסיף את המדיום כדי לאפשר תנועה איטית ומבוקרת יותר, מניעת תזוזה של הפיגומים. אם אתם עובדים עם מספר גבוה מאוד של פיגומים, השתמשו בפיפט של 10 מ”ל כאשר אקדח הפיפטה מוגדר ל’נפילה’ ו’נמוכה’. יש לדגור על צלחות 24 בארות למשך הלילה (37°C, 5%CO2 ו-95% לחות). תחזוקת תאים על הפיגומיםלאחר 24 השעות הראשונות של חיבור התאים (יום 1), מעבירים את פיגומי הזרעים ללוחות חדשים שאינם דבקים ב-24 בארות, ומוסיפים 1-2 מ”ל של מצע גידול טרי.הערה: שלב זה מסיר תאים שנפלו לתחתית לוחות הפלסטיק בעלי 24 הקידוחים במקום לאפשר להם לגדול על הפיגומים. העתקי פיגומים שנקבעו ליום 1 יוסרו לאחר 24 שעות, כאמור בסעיף 5; לפיכך, התחזוקה אינה חלה על פיגומים אלה. לפקח על הפיגומים בתחילה כל 2-3 ימים לשינוי צבע של מדיום הגידול. ככל שהזמן מתקדם והתאים מתרבים בתוך הפיגומים, מזינים את התאים בתדירות גבוהה יותר. באמצעות אקדח פיפטה 10 מ”ל, במצב איטי, להסיר את 1 מ”ל של המדיום בילה ולהשליך. אם אתם מבצעים ניסויים הדורשים תווך מותנה, אספו את התווך המשומש של העתקים ביולוגיים בצינור צנטריפוגה של 15 מ”ל, צנטריפוגה ב 340 × גרם למשך 2 דקות כדי להשליך את פסולת התא, העבירו את הסופרנאטנט לצינור טרי, ואחסנו ב -80 מעלות צלזיוס. מוסיפים בעדינות 2 מ”ל של מצע גידול שחומם מראש לפיגומים, באמצעות פונקציית הטפטוף שוב על הפיפטה, ומחזירים את צלחת 24 הבארות לאינקובטור (37°C, 5% CO2 ו-95% לחות). חזור על הפעולה בכל פעם שהמדיום מושקע למשך תקופת הצמיחה הרצויה. 5. שליפת פיגומים ויישומים הערה: בכל נקודת זמן, ניתן להשתמש במספר יישומים כדי לעקוב אחר גדילת תאים על הפיגומים או להעריך פרופילי ביטוי גנים וחלבונים. תנאי שליפת הפיגום יהיו תלויים בניתוח שיבוצע, עם שיטות שליפה מרובות המתוארות בסעיפים הבאים ומודגמות באיור 4. הערכת כדאיות התא בתוך פיגומיםלעקר את מגיב בדיקת כדאיות התא המתאים על ידי סינון דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. מחממים מראש תמיסה סטרילית זו יחד עם PBS צמיחה מלאה בינונית וסטרילית באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להעביר את הפיגומים לניתוח לצלחת טרייה בת 24 בארות. תייגו את הצלחת עם כל הפרטים הרלוונטיים.הערה: בצע את הניתוח במשולש. הוסף 900 μL של מדיום הגידול המחומם מראש לכל באר, ואחריו 100 μL של מגיב הכדאיות התא הסטרילי. כלול בקרה שלילית על ידי הוספת 900 μL של בינוני ו 100 μL של מגיב קיימא התא סטרילי לבאר ללא פיגום. החלף את המכסה בצלחת, וניער בעדינות את הצלחת למשך ~3 דקות כדי לפזר באופן שווה את מגיב הכדאיות התא המדולל ברחבי הבאר. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-95% לחות.הערה: יהיה צורך למטב את זמני הדגירה עבור כל קו תאים; עיין בהנחיות היצרן. עבור שורות תאי נוירובלסטומה, דגירה של 4-6 שעות נראית אופטימלית. לאחר הדגירה, מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומנדנדים אותה בעדינות למשך מספר שניות. במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, פתחו צלחת חדשה ושקופה בעלת 96 בארות. מכל באר בצלחת 24 הקידוחים, מעבירים את המדיום המודגר והמגיב לשלוש בארות של צלחת 96 בארות עם 100 מיקרוליטר לבאר, תוך מתן טריפליקטים טכניים.הערה: העברה זו תשאיר 700 μL בבארות של צלחת 24 בארות. כסו את הצלחת בעלת 96 הבארות ברדיד אלומיניום כדי להגן על מגיב הכדאיות של התא מפני אור. מוציאים ומשליכים את 700 מיקרוליטר הנותרים של תכולת הבאר מכל פיגום בצלחת בת 24 הקידוחים. שטפו כל פיגום פעמיים עם 1 מ”ל PBS סטרילי.הערה: כל הצבע לא יוסר מהפיגומים. פיגומים אלה יכולים לשמש ליישומים נוספים, למשל כימות דנ”א, על-ידי הצבתם ב-1 מ”ל של 1% טריטון X-100 בתמיסת נתרן ביקרבונט 0.1 מ’ (NaHCO3) ואחסונם בטמפרטורה של -80°C (ראו סעיף 5.2, איור 4B). הסר את לוח 96 הקידוחים ממכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ומדוד את הבליעה של כל באר באורכי גל של 570 ננומטר ו- 600 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות. רשום את ערכי הבליעה בשני אורכי הגל ופעל לפי הוראות היצרן כדי לחשב את אחוז ההפחתה של מגיב הכדאיות התאית על ידי התאים. גרף וניתוח סטטיסטי של תוצאות כדאיות התא באמצעות תוכנה מתאימה. הזן ערכים משולשים ביולוגיים כדי לייצר קווי שגיאה ולציין את השתנות המבחן. כדי לבחון שינויים בכדאיות התא לאורך פרק הזמן של הניסוי, בצע ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) עם השוואות מרובות של האמצעים באמצעות תוכנה ביוסטטיסטית מתאימה. ציין הבדלים משמעותיים בין נקודות הזמן בגרפים כ- ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) ו- **** (P≤0.0001). איור 4: שליפת פיגומים לניתוחים שונים בכל נקודת זמן. (A) שלושה פיגומים משוכפלים מאוחזרים לצורך ניתוח כדאיות התא. (B) לאחר מכן ניתן לשטוף את הפיגומים האלה ב-PBS, למקם אותם ב-1% Triton X-100 ב-0.1 M NaHCO3, ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80°C לצורך כימות DNA. (C) שלושה עותקים משוכפלים נוספים קבועים ב-10% PFA למשך 15 דקות, מנוטרלים ב-PBS ומאוחסנים ב-4°C לצורך צביעה והדמיה היסטולוגית. (D) לבסוף, 3 עותקים משוכפלים מתווספים למגיב ליזה תאי מבוסס פנול/גואנידין ומאוחסנים בטמפרטורה של -20°C לצורך ניתוח ביטוי גנים. קיצורים: PBS = מלח חוצץ פוספט; PFA = paraformaldehyde. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. כימות הדנ”א מהתאים בפיגומיםהערה: כפי שצוין בהערה לאחר שלב 5.1.7, שליפת הפיגומים לצורך כימות DNA כרוכה בהכנסת הפיגומים לתוך צינורות צנטריפוגות 2 מ”ל המכילים 1 מ”ל של 1% טריטון X-100 בתמיסת 0.1 M NaHCO3 ואחריה אחסון ב -80 ° C. לפני שניתן יהיה לבצע ניתוח DNA, התאים חייבים לעבור שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה כדי לשכב את תאי הנוירובלסטומה כראוי ולשחרר DNA לכימות.הסר את הדגימות שאוחסנו בעבר ב- Triton X-100 מ- -80°C. השאירו את הדגימות ב- RT למשך 1-3 שעות או עד להפשרה. מערבלים את הדגימות במשך 10-20 שניות, ומחזירים את הדגימות לטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות או עד להקפאה מלאה. חזור על תהליך זה במשך שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה. כדי למקסם את תפוקת הדנ”א, השתמשו בליזר רקמות כדי לשבש את התאים בפיגומים.מניחים חרוז מתכת בצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ”ל המכיל פיגום בטריטון X-100, ומניחים את הצינור בתוך המתאם כדי לנער את הדגימה במהירות של 50 תנודות לשנייה למשך 2-3 דקות.הערה: השתמש בצינורות צנטריפוגות בעלי תחתית עגולה מכיוון שחרוז המתכת עלול להיתקע בצינור בעל תחתית מחודדת. כמת את הדנ”א בתמיסת Triton X-100 על ידי יישום כתם DNA דו-גדילי פלואורסצנטי (dsDNA) ומדידת הפליטה באמצעות קורא מיקרו-לוחות. עיין בהנחיות היצרן; דללו את הדגימות כראוי במאגר Tris-ethylenediamine tetraacetic acid (TE) כדי להכין 8 תקני dsDNA באמצעות דילול סדרתי במאגר TE (איור 5). בלוחות שחורים אטומים של 96 בארות, מוסיפים 100 מיקרוליטר מכל תקן או דגימה לבארות בשלשה טכנית. דללו את כתם dsDNA הפלואורסצנטי פי 200 במאגר TE והוסיפו 100 μL לכל תקן/דגימה באמצעות פיפטה רב ערוצית. מכסים את הצלחת בטינפויל ודגרים ב-RT במשך 5 דקות. מדוד ורשום את הפלואורסצנטיות של כל באר ב 520 ננומטר. פעל בהתאם להנחיות היצרן כדי לחשב את ריכוז ה- DNA בכל דגימה.הערה: אם הריכוז הממוצע של דנ”א לתא ידוע עבור קו התא שבו נעשה שימוש, ניתן להמיר את ערכי ריכוז הדנ”א למספרי תאים באמצעות משוואה (4).(4) גרף וניתוח סטטיסטי של תוצאות כימות ה- DNA באמצעות תוכנה מתאימה. הזן ערכים משולשים ביולוגיים כדי לייצר קווי שגיאה ולציין את השתנות המבחן. כדי לבחון את השינויים בריכוז הדנ”א / מספרי התאים במהלך פרק הזמן של הניסוי, בצע בדיקת ANOVA חד-כיוונית עם השוואות מרובות של האמצעים באמצעות תוכנה ביוסטטיסטית מתאימה. ציין הבדלים משמעותיים בין נקודות הזמן בגרפים כ- ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) ו- **** (P≤0.0001). איור 5: הכנת שמונה תקני דנ”א ליצירת עקומה סטנדרטית. תמיסת מלאי של λDNA מסופקת ב 100 מיקרוגרם / מ”ל. זה מדולל פי 50 בחיץ TE כדי ליצור תקן A ב 2000 ng / mL; 400 μL של A מועבר לאחר מכן לצינור B, המכיל 400 μL TE buffer; 400 μL של B מועבר ומדולל פי 2 ב-C, וכך הלאה עד ש-G. תקן H מורכב ממאגר TE בלבד ולכן יש לו ריכוז DNA של 0 ng/mL. קיצור: TE = Tris-EDTA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הכנת פיגומים לצביעה היסטולוגיתהערה: פיגומים ניתנים לקיבוע ולצביעה למטרות מיקרוסקופיה והדמיה כפיגומים שלמים לאימונופלואורסנציה (IF) או כפרוסות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) לצביעה היסטולוגית או אימונוהיסטוכימיה (IHC). זה מאפשר הערכה איכותית של חדירת תאים והפצה בתוך פיגומים וניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הביטוי של חלבונים.הכינו תמיסת 10% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS. ודא שיש מספיק פתרון עבור נפח סופי של 500 μL לכל פיגום. חממו מראש תמיסה זו ב-37°C והוסיפו 500 μL לצינורות צנטריפוגות 2 מ”ל מסומנים לאחזור פיגומים. מוציאים את הפיגומים מלוחות 24 הקידוחים שאינם דבקים (שלב 4.4.4) ומניחים אותם במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. באמצעות פינצטה סטרילית, מעבירים את הפיגומים לצינורות הצנטריפוגות המסומנים המכילים 10% PFA. אפשר לפיגומים להתקבע בתמיסת PFA למשך 15 דקות. נטרל את ה- PFA על ידי הוספת PBS של 500 μL לכל צינור ואחסן ב- 4 ° C. כדי להכין את הפיגומים למעבד הרקמות האוטומטי, הסירו אותם מ-4°C והשתמשו בפינצטה כדי להניח אותם בקלטות פלסטיק עם כל הפרטים הרלוונטיים בעיפרון. מניחים את כל הקלטות במיכל המתכת של מעבד הרקמות. התחל את פרוטוקול 12 השלבים במעבד הרקמות כדי לתקן, לייבש, לנקות את הפיגומים ולהחדיר אותם עם פרפין למשך הלילה. אספו את הקלטות המכילות את הדגימות המעובדות. לאחר מכן, הטמיעו את הפיגומים בגושי שעוות פרפין כדי לאפשר מיקרוטומיה של הפיגומים לפרוסות דקות מאוד להכתמה.הערה: חשוב במיוחד לקחת בחשבון את כיוון הפיגומים בעת הוצאתם מהקלטות והטמעתם בשעווה, שכן הדבר ישפיע על הזווית בה יצולמו התמונות. זה חשוב בעת הערכת חדירת תאים לתוך הפיגומים. הפעל את הטמעת השעווה ואת הצלחת הקרה; הרימו את המכסה כדי לבדוק את גובה השעווה. מלאו מחדש במידת הצורך. בעבודה עם דגימה אחת בכל פעם, פותחים את הקלטת, מסירים את הפיגום ומרכזים אותו בתבנית הפלסטיק. יוצקים שעווה חמה על הדגימה, מבטיחים שמירה על כיוון נכון ומתאימים עם פינצטה חמה, במידת הצורך, לפני שהשעווה מתמצקת. יוצקים עוד שעווה כדי למלא את התבנית. מניחים את מכסה הקלטת המסומן על גבי תבנית הפלסטיק ומוסיפים שעווה מעל. מניחים את התבנית על צלחת קרה כדי למצק את השעווה. יש לאחסן למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C כדי להבטיח ששעוות הפרפין תתמצק במלואה לפני המיקרוטומיה. כדי להתכונן למיקרוטומיה, הפעילו אמבט מים בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס, את צלחת הייבוש ואת המיקרוטום. הכנס להב למחזיק והודק את הידית כדי לאבטח אותו. קבעו את עובי החיתוך והחתך, בדרך כלל 5 מ”מ לחלקי פיגומים. מוציאים את פיגום ה-FFPE מהתבנית, מאחסנים אותו במחזיק שבחזית המיקרוטום, וקוצצים בזהירות את עודפי השעווה סביב שולי הדגימה לפני חיתוך החתכים. התחילו לחתוך לתוך גוש השעווה על ידי סיבוב הידית של המיקרוטום, מה שמבטיח תנועה חלקה. אספו חלקים דמויי סרט, סביב 3 חלקי פיגומים בכל פעם, והניחו אותם בעדינות באמבט מים בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס כדי להסיר קמטים. הפרידו בעדינות את החלקים באמבט המים באמצעות פינצטה. באמצעות מגלשות מיקרוסקופ זכוכית מצופות פוליזין, הרימו כל קטע מאמבט המים כך שהקטע ישב במרכז המגלשה. תייג כל שקופית בעיפרון. הניחו את מגלשות הזכוכית על צלחת הייבוש או בתנור ייבוש בטמפרטורה של 60°C. לאחר הייבוש, יש לאחסן אותם בטמפרטורה של 4°C ולהמשיך עם הכתם ההיסטולוגי או IHC הנדרש. שליפת פיגומים לניתוח ביטוי גניםמוציאים את הפיגומים מלוחות 24 הקידוחים שאינם דבקים מהאינקובטור (שלב 4.4.4) ומניחים אותם במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. באמצעות פינצטה סטרילית, מעבירים את הפיגומים לצינורות צנטריפוגות טריים מסומנים בנפח 2 מ”ל. במכסה אדים, יש להוסיף 1 מ”ל של מגיב ליזה תאי מבוסס פנול/גואנידין לכל צינור כדי לשכב את התאים בפיגומים ולאפשר התאוששות של RNA באיכות גבוהה. יש לאחסן את הצינורות בטמפרטורה של -20°C עד שהם מוכנים לביצוע מיצוי RNA באמצעות ערכה מתאימה. באמצעות תגובת שרשרת כמותית סטנדרטית של פולימראז בשעתוק לאחור (RT-qPCR)17, יש להעריך את ביטוי הגנים בתאים בפיגומים.