Modèle biomimétique in vitro tridimensionnel de neuroblastome à l’aide d’échafaudages à base de collagène

1. Plan d’expérience REMARQUE : Le nombre d’échafaudages et de cellules nécessaires pour chaque expérience dépendra de l’échelle de l’expérience et peut être calculé à l’aide des outils de cette section sur le plan expérimental. Nombre d’échafaudages requisDéterminer l’échéancier expérimental global et les intervalles d’évaluation des changements dans la biologie cellulaire (p. ex., croissance cellulaire et métabolisme).REMARQUE : Par exemple, la période expérimentale est de 14 jours, avec une évaluation de la croissance cellulaire tous les 7 jours. Ainsi, les points de temps expérimentaux sont les jours 1, 7, 14 donnant un total de 3 points de temps. Ensuite, décidez du nombre d’applications expérimentales à appliquer à chaque point temporel. Essayez d’effectuer les mêmes analyses à chaque point de temps pour surveiller les changements.REMARQUE : Les analyses typiques de la croissance cellulaire sur les échafaudages comprennent des tests de viabilité cellulaire, la quantification de l’ADN, la coloration histologique et l’imagerie, ainsi que l’analyse de l’expression génique. Ceux-ci seront examinés plus en détail dans la section 5. Décider quand utiliser le même échafaudage pour plusieurs applications en aval, par exemple, après l’évaluation de la viabilité cellulaire à l’aide d’un test approprié, réutiliser l’échafaudage pour l’isolement de l’ADN/ARN (voir 5.1.11). Conservez un minimum de 3 répétitions biologiques pour chaque application, par exemple, 3 échafaudages pour la viabilité cellulaire et la quantification de l’ADN, 3 pour l’histologie et 3 pour l’analyse de l’expression génique. Comme cela équivaut à 9 échafaudages par point de temps, prévoyez d’utiliser 27 échafaudages pour 3 points de temps. Enfin, multipliez ce nombre par le nombre de paramètres ou de conditions expérimentales (p. ex., évaluation de plusieurs lignées cellulaires, densités initiales de semis, composition d’échafaudage).NOTA : Dans le cadre de ce protocole, 4 densités de semis initiales différentes ont été évaluées pour une lignée cellulaire, ce qui a donné lieu à 108 échafaudages (27 échafaudages x 4 conditions) requis. Pour tenir compte de l’erreur humaine et donner une couverture supplémentaire, ajoutez ~10% à ce nombre, par exemple, si 108 échafaudages sont nécessaires, préparez 120 échafaudages. Nombre de cellules requisesREMARQUE : Un volume de 20 μL de suspension cellulaire est recommandé pour l’ensemencement des cellules sur un échafaudage cylindrique (diamètre 6 mm, hauteur 4 mm) le jour 0. Le nombre de cellules par ces 20 μL de suspension cellulaire est ajusté en fonction du plan expérimental, calculé à la section 1.1. Une densité de semis initiale courante est de 2 × 105 cellules par 20 μL, utilisée à titre d’exemple pour le protocole ci-dessous.Pour calculer le nombre total de cellules nécessaires à l’expérience, multipliez les 2 × 105 cellules initiales par 20 μL par le nombre d’échafaudages nécessaires.REMARQUE : Par exemple, 30 échafaudages multipliés par 20 μL donnent un volume total de 600 μL. Si chaque échafaudage nécessite 2 × 10 5 cellules, 600 μL de suspension contiennent un total de 6 × 10 6 cellules (2 × 105 × 30), ce qui donne un besoin final de 6 × 106 cellules dans 600 μL. Le nombre de paramètres expérimentaux déterminera le nombre total de cellules requises. Ce protocole décrit donc la culture cellulaire à l’aide d’un flacon de culture cellulaire multicouche, qui peut traiter le même nombre de cellules que 10 flacons traditionnels de 175 cm2. 2. Préparation d’échafaudages à base de collagène NOTE : Les échafaudages cylindriques Coll-I-nHA et Coll-I-GAG (diamètre 6 mm, hauteur 4 mm) sont préparés selon les méthodes établies 15,21,27. Une fois réticulés chimiquement selon les méthodes précédemment publiées17, les échafaudages doivent être utilisés dans un délai de 1 semaine. Après la fabrication des échafaudages ayant les propriétés mécaniques souhaitées, assurez-vous que les échafaudages sont complètement hydratés et soigneusement lavés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).REMARQUE : Cela prend généralement ~12 h après la réticulation des échafaudages et peut être effectué dans des conteneurs de déchets de culture tissulaire de 100 mL à 4 °C, avec un maximum de 50 échafaudages par conteneur et 2 mL de PBS par échafaudage. Conservez les échafaudages dans du PBS à 4 °C jusqu’au moment de les utiliser. 3. Propager les cellules de neuroblastome dans un flacon de culture cellulaire multicouche REMARQUE : La densité de semis optimale pour la fiole multicouche varie. Pour le flacon utilisé dans cette expérience, la densité optimale selon les instructions du fabricant est de 1 × 107 cellules. Avant d’ensemencer la fiole multicouche, propager les cellules à une densité de 1 × 107 cellules ou plus dans une fiole de culture tissulaire appropriée (p. ex., une fiole de culture tissulaire T175 cm2 ). Pour ensemencer des cellules dans le ballon multicouche (section 3.1), les cultiver jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 70-80 %, récolter et compter le nombre de cellules par mL, en se référant aux étapes 3.2.16-3.2.20 pour effectuer le comptage cellulaire. Une fois la suspension cellulaire comptée, procéder immédiatement à l’ensemencement de la fiole multicouche. Le travail de culture cellulaire doit être effectué dans une hotte à flux laminaire pour maintenir la stérilité. Ensemencement de la fiole de culture cellulaire multicouchePréchauffer 550 mL de milieu de culture complet (varie en fonction de la lignée cellulaire utilisée) et 100 mL de PBS stérile dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min. À l’aide de la suspension cellulaire récoltée, calculez le volume requis de la suspension cellulaire nécessaire pour atteindre la densité de semis optimale de 1 × 107 cellules à l’aide de l’équation (1), où WANT fait référence au nombre de cellules nécessaires à l’ensemencement de la fiole multicouche, et HAVE fait référence au nombre de cellules/mL dans la suspension cellulaire :(1)p. ex., Ajouter le volume requis de la suspension cellulaire à 100 mL du milieu de culture préchauffé. Prenez une nouvelle fiole multicouche dans le capot, retirez le bouchon et tenez la fiole à un angle de 60°. Pipeter lentement les 100 mL de la suspension cellulaire dans le flacon, le long du côté incliné du goulot. Fermez le flacon et placez-le sur le côté pour permettre aux cellules de se répartir uniformément dans les couches. À un angle de 60°, ajouter 400 mL du milieu de culture préchauffé dans la fiole multicouche en versant lentement ou en pipetant le côté incliné du goulot. Si le goulot est plein, remettez la fiole en position verticale ou bouchez la fiole et placez-la sur le côté avant de la remettre à verser.REMARQUE : Versez lentement pour éviter la formation excessive de bulles. Tapotez doucement le flacon en position verticale pour permettre à toutes les bulles de remonter vers le haut et retirez-les à l’aide d’une pipette de 10 ml. Assurez-vous que la fiole est remplie jusqu’au filetage inférieur du goulot ; Ajoutez plus de milieu, si nécessaire, pour y parvenir. Bouchez la fiole multicouche et incubez-la avec le col incliné vers le bas à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité. Vérifiez la croissance tous les 2-3 jours pour la confluence. Pour vérifier la confluence des deux couches inférieures de la fiole multicouche, observez-les sous l’objectif 4x d’un microscope inversé.REMARQUE : Lorsqu’il est ensemencé avec 1 × 107 cellules de neuroblastome, le flacon à 10 couches prendra généralement une semaine pour devenir confluent, bien que cela puisse varier en fonction de la lignée cellulaire utilisée. Entretien courant des cellules dans la fiole multicouchePréchauffer 550 mL de milieu de culture complet (varie selon la lignée cellulaire utilisée), 50 à 100 mL de trypsine et 300 mL de PBS stérile dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min. Vérifiez que la fiole multicouche a une confluence de 70 à 80 %. Placez la fiole multicouche dans une hotte à flux laminaire et jetez le milieu usé de la fiole en versant. Dans un premier temps, inclinez le ballon de manière à ce que le fluide se déverse sur le barrage d’air dans un conteneur à déchets. Pendant le versement, faites pivoter le flacon de 180° jusqu’à ce que le fluide s’écoule le long du col incliné du flacon. Faites pivoter le ballon d’avant en arrière le long de cet axe pour éliminer tout liquide restant. Lavez les cellules en ajoutant lentement 100 ml de PBS stérile préchauffé le long du goulot incliné. Bouchez le flacon, placez-le sur le côté pour permettre une distribution uniforme du PBS et faites pivoter le flacon d’avant en arrière pour laver les cellules. Jeter le nettoyant PBS de la même manière que 3.2.3. Répétez les étapes de lavage. Diluer 50 mL de trypsine préchauffée dans 50 mL de PBS stérile préchauffé. Ajouter 100 mL de solution de trypsine diluée dans la fiole multicouche, bouchon et placer la fiole sur le côté pour permettre une distribution uniforme de la trypsine. Si la lignée cellulaire est très adhérente, utilisez 100 mL de trypsine non diluée. Incuber le flacon pendant 2 à 5 minutes à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité, en surveillant le décollement cellulaire au microscope. Si nécessaire, tapotez fermement le flacon pour faciliter le détachement ou replacez-le dans l’incubateur pendant une minute de plus. Placez la fiole multicouche dans une hotte à flux laminaire et neutralisez la trypsine avec 100 mL de milieu de culture. Bouchez le flacon, placez-le sur le côté et balancez-le d’avant en arrière pour assurer une neutralisation complète. Versez la suspension cellulaire neutralisée dans 4 tubes à centrifuger coniques de 50 ml.REMARQUE : Si un prélèvement complet de cellules est nécessaire, laver à nouveau le ballon multicouche avec 100 mL de PBS stérile et le verser dans 2 tubes à centrifuger de 50 mL. Centrifuger la suspension cellulaire dans des tubes à centrifuger de 50 ml à 340 × g pendant 3 à 4 min pour granuler les cellules. Remettez les tubes de centrifugation dans la hotte à flux laminaire et jetez soigneusement autant de surnageant que possible de chaque pastille.REMARQUE : Le granulé sera gros et relativement lâche et, par conséquent, peut être facilement perturbé. Ajouter 1 à 5 ml de milieu de culture à chaque pastille et la remettre en suspension en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Regroupez les 4 pastilles remises en suspension dans un tube à centrifuger de 50 ml, mélangez-les soigneusement avec la pipette et notez le volume total. Faire une dilution appropriée de la suspension cellulaire pour le comptage cellulaire afin que chaque carré extérieur de l’hémocytomètre contienne 30 à 100 cellules.REMARQUE : Une dilution de départ appropriée est de 1 :100 ; pour cela, pipeter 10 μL de la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique frais de 15 mL et le diluer avec 990 μL de PBS stérile. Pipeter le mélange de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger. Placez un tube à centrifuger de 50 ml contenant le stock de cellules dans l’incubateur pendant le comptage. À l’aide d’un hémocytomètre propre, placez une lamelle propre sur la grille, comme illustré à la figure 2. Pipeter 10 μL de la suspension cellulaire diluée dans la chambre de l’hémocytomètre. Si la chambre est pleine avant que la totalité des 10 μL ne soit distribuée, arrêtez le pipetage. Placez l’hémocytomètre sous l’objectif 4x d’un microscope optique. Ajustez la mise au point grossière et fine pour visualiser les cellules. Comptez le nombre de cellules dans les quatre carrés d’angle extérieurs de la chambre, comme indiqué à la figure 2. Additionnez les quatre comptes et divisez par 4 pour calculer la moyenne des cellules par carré. Figure 2 : Comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Dix microlitres de suspension cellulaire sont ajoutés à l’hémocytomètre sous la lamelle. La chambre est ensuite placée sous l’objectif 4x d’un microscope et le nombre de cellules dans les quatre coins extérieurs de la grille est compté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Multipliez le nombre moyen par le facteur de dilution (p. ex., 100) et multipliez ce nombre par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules par ml à l’aide de l’équation (2). (2) Calculer le nombre total de cellules dans la solution mère en multipliant par le volume total de la cellule (p. ex., si les 4 pastilles remises en suspension ont donné une solution de 20 mL, multiplier le nombre de cellules/mL par 20). Pour maintenir la fiole multicouche, utilisez l’équation (1) décrite à l’étape 3.1.2 pour calculer le volume de cellules nécessaires pour réensemencer 1 × 107 cellules dans la fiole et effectuez les étapes 3.1.3 à 3.1.6 pour réensemencer la fiole. Si vous êtes prêt à ensemencer les échafaudages, passez à la section suivante. 4. Semer des cellules de neuroblastome sur des échafaudages Préparer la suspension de la cellule d’origineREMARQUE : Ce protocole décrit les étapes de création de quatre densités d’ensemencement différentes de cellules de neuroblastome, avec un facteur de multiplication de 2 entre chaque densité. Une dilution en série sera donc utilisée pour créer trois autres suspensions cellulaires à partir de la suspension mère. Le travail de culture cellulaire doit être effectué dans une hotte à flux laminaire pour maintenir la stérilité.Utiliser l’équation (3) pour calculer le volume de cellules nécessaires à partir du nombre total de cellules dans la fiole multicouche (compté à la section 3.2.19) pour préparer la première densité de semis ou la première suspension de cellules.(3)NOTA : Par exemple, si la densité de semis la plus élevée est de 6 × 10 5 cellules par échafaudage requises pour 30 échafaudages, chaque échafaudage recevant 20 μL de suspension cellulaire, la suspension de cellules d’origine nécessitera 1,8 × 107 cellules (6 × 105 cellules × 30 échafaudages) dans un volume total de 600 μL (20 μL × 30 échafaudages).Comme une dilution en série sera effectuée à partir de cette préparation, ces nombres doivent être doublés, c’est-à-dire 3,6 × 107 cellules dans un volume total de 1200 μL. Pour convertir cela en WANT en cellules par mL ; diviser 3,6 × 10 7 par 1200 μL et multiplier par 1000 μL, ce qui donne 3 × 107 cellules par mL.​ Ajouter le volume requis de cellules dans un tube à centrifuger stérile de 2 mL ou 15 mL et porter à un volume final de 1200 μL avec le milieu de culture. Étiquetez ce tube comme étant de densité 1 (Figure 3). Effectuez une dilution en série pour créer plusieurs suspensions cellulaires de densité de semis.À partir de la densité 1 préparée à l’étape 4.1.1, préparez trois autres densités de suspension cellulaire par dilution en série comme indiqué à la figure 3. Diluer chaque densité d’un facteur 2 dans le milieu de culture. Tout d’abord, ajoutez le volume final requis (600 μL par rapport à l’exemple précédent) de milieu de culture à trois tubes à centrifuger stériles de 2 mL ou 15 mL. Transférer la moitié de la densité 1 (600 μL) dans l’un des tubes, en mélangeant soigneusement la suspension cellulaire avec le milieu à diluer. Étiquetez ce tube comme étant de densité 2. Transférer la moitié de la densité 2 (600 μL) dans le tube suivant, en mélangeant soigneusement la suspension cellulaire avec le milieu à diluer. Étiquetez ce tube comme étant de densité 3. Transférer la moitié de la densité 3 (600 μL) dans le tube suivant, en mélangeant soigneusement la suspension cellulaire avec le milieu à diluer. Étiquetez ce tube comme étant de densité 4. Éliminer 600 μL de la densité 4 afin que les quatre préparations aient un volume final de 600 μL. Comme témoin négatif, ajouter 600 μL de milieu de culture uniquement dans un tube à centrifuger stérile de 2 mL. Voir la figure 3 pour un schéma du processus de dilution en série. Figure 3 : Dilution en série de cellules pour préparer 4 suspensions pour 4 densités de semis d’échafaudages différentes. (A) Les nombres peuvent être ajustés en fonction de la densité de semis souhaitée par échafaudage et (B) multipliés par le nombre total d’échafaudages par densité, chaque échafaudage recevant 20 μL de suspension cellulaire. Dans cet exemple, la densité 1 nécessite 6 × 105 cellules par échafaudage, ce qui équivaut à 1,8 × 107 cellules dans 600 μL pour 30 échafaudages. Ce nombre est doublé pour commencer la dilution en série, car 600 μL sont ensuite transférés et dilués dans 600 μL de milieu de culture dans le tube suivant. Ce processus se poursuit jusqu’à ce qu’il y ait 4 suspensions cellulaires avec un facteur de 2 entre chacune. Un contrôle négatif est obtenu en ajoutant 600 μL de milieu seulement dans un tube. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Ajout de suspensions cellulaires aux échafaudagesREMARQUE : Retirez les échafaudages (stockés dans PBS) du réfrigérateur et laissez-les revenir à température ambiante (RT) avant d’ajouter les cellules.Amenez les échafaudages en PBS dans la hotte à flux laminaire. À l’aide d’une pince à épiler stérile, placez les échafaudages dans des plaques non adhérentes à 24 puits avec un échafaudage par puits (figure 1C). Soulevez doucement les échafaudages par leurs coins et pressez-les légèrement contre le côté du récipient pour éliminer l’excès de PBS. Ajoutez les échafaudages au centre des puits, côté peau vers le bas (le côté de la couche brillante de l’échafaudage, face vers le bas dans les plaques en plastique à 24 puits). Étiquetez les plaques à 24 puits avec les détails de la lignée cellulaire, les paramètres pertinents (par exemple, la densité d’ensemencement) et les points temporels. Travaillez avec une densité d’ensemencement cellulaire à la fois, en conservant les densités restantes dans l’incubateur à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. Dans la hotte à flux laminaire, utilisez une pipette P20 et des pointes stériles pour ajouter délicatement 20 μL de la suspension cellulaire correspondante au centre de chaque échafaudage (Figure 1D). Gardez les cellules bien en suspension en mélangeant bien tout en ajoutant les cellules aux échafaudages. Assurez-vous que la suspension reste sur le dessus de l’échafaudage et ne glisse pas sur la base du puits, car cela ne permettra pas la fixation de la cellule à l’échafaudage. Une fois les cellules ajoutées, incubez les plaques pendant 3 à 5 h (37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité) pour permettre à la plupart des cellules de se fixer. Après l’incubation, ajouter lentement et doucement 1 mL de milieu de culture préchauffé dans chaque puits (figure 1E). Utilisez une pipette P1000 pour ajouter le milieu afin de permettre un mouvement plus lent et contrôlé, empêchant ainsi le déplacement des échafaudages. Si vous travaillez avec un très grand nombre d’échafaudages, utilisez une pipette de 10 ml avec le pistolet à pipette réglé sur « goutte » et « bas ». Incuber les plaques à 24 puits pendant une nuit (37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité). Entretien des cellules sur les échafaudagesAprès les 24 premières heures de fixation des cellules (jour 1), transférez les échafaudages ensemencés sur de nouvelles plaques non adhérentes à 24 puits et ajoutez 1 à 2 ml de milieu de culture frais.REMARQUE : Cette étape enlève les cellules qui sont tombées au fond des plaques en plastique à 24 puits plutôt que de les laisser se développer sur les échafaudages. Les répliques d’échafaudage désignées comme jour 1 seront démontées après 24 h, comme il est indiqué à la section 5 ; Par conséquent, l’entretien ne s’applique pas à ces échafaudages. Surveillez d’abord les échafaudages tous les 2-3 jours pour un changement de couleur du milieu de culture. Au fur et à mesure que le temps passe et que les cellules prolifèrent dans les échafaudages, nourrissez les cellules plus fréquemment. À l’aide d’un pistolet à pipette de 10 mL, en mode lent, retirez le 1 mL du milieu usagé et jetez-le. Si l’on effectue des expériences nécessitant un milieu conditionné, recueillir le milieu usé des répétitions biologiques dans un tube à centrifuger de 15 mL, centrifuger à 340 × g pendant 2 min pour granuler les débris cellulaires, transférer le surnageant dans un tube neuf et stocker à -80 °C. Ajouter délicatement 2 mL de milieu de culture préchauffé dans les échafaudages, en utilisant à nouveau la fonction goutte à goutte sur la pipette, et remettre la plaque à 24 puits dans l’incubateur (37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité). Répétez chaque fois que le milieu est dépensé pendant la durée de la période de croissance souhaitée. 5. Récupération et applications d’échafaudages REMARQUE : À chaque instant, plusieurs applications peuvent être utilisées pour surveiller la croissance cellulaire sur les échafaudages ou évaluer les profils d’expression des gènes et des protéines. Les conditions de récupération de l’échafaudage dépendront de l’analyse à effectuer, avec plusieurs méthodes de récupération décrites dans les sous-sections suivantes et illustrées à la figure 4. Évaluation de la viabilité cellulaire à l’intérieur d’échafaudagesStériliser le réactif de test de viabilité cellulaire approprié en le filtrant à travers un filtre stérile de 0,2 μm dans un tube à centrifuger dans la hotte à flux laminaire. Préchauffer cette solution stérile avec le milieu de culture complet et le PBS stérile dans un bain-marie à 37 °C. Dans la hotte à flux laminaire, utilisez une pince à épiler stérile pour transférer les échafaudages à analyser sur une plaque fraîche à 24 puits. Étiquetez la plaque avec tous les détails pertinents.REMARQUE : Effectuez l’analyse en trois exemplaires. Ajouter 900 μL du milieu de culture préchauffé dans chaque puits, puis 100 μL du réactif stérile de viabilité cellulaire. Inclure un témoin négatif en ajoutant 900 μL de milieu et 100 μL de réactif de viabilité des cellules stériles dans un puits sans échafaudage. Replacez le couvercle sur la plaque et balancez doucement la plaque pendant ~3 min pour répartir uniformément le réactif de viabilité cellulaire dilué dans tout le puits. Incuber la plaque à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.REMARQUE : Les temps d’incubation devront être optimisés pour chaque lignée cellulaire ; Reportez-vous aux directives du fabricant. Pour les lignées cellulaires de neuroblastome, une incubation de 4 à 6 h semble optimale. Après l’incubation, retirez l’assiette de l’incubateur et balancez-la doucement pendant quelques secondes. Dans la hotte à flux laminaire, ouvrez une nouvelle plaque translucide à 96 puits. À partir de chaque puits de la plaque à 24 puits, transférer le milieu incubé et le réactif dans trois puits de la plaque à 96 puits à raison de 100 μL par puits, en obtenant des triplicats techniques.REMARQUE : Ce transfert laissera 700 μL dans les puits de la plaque à 24 puits. Couvrez la plaque à 96 puits d’une feuille d’aluminium pour protéger le réactif de viabilité de la cellule de la lumière. Retirez et jetez les 700 μL restants du contenu du puits de chaque échafaudage de la plaque à 24 puits. Lavez chaque échafaudage deux fois avec 1 mL de PBS stérile.REMARQUE : Toutes les couleurs ne seront pas retirées des échafaudages. Ces échafaudages peuvent ensuite être utilisés pour d’autres applications, par exemple la quantification de l’ADN, en les plaçant dans 1 mL de Triton X-100 à 1 % dans une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO3) à 0,1 M et en les stockant à -80 °C (voir rubrique 5.2, Figure 4B). Retirez la plaque à 96 puits de la hotte à flux laminaire et mesurez l’absorbance de chaque puits à des longueurs d’onde de 570 nm et 600 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Enregistrez les valeurs d’absorbance aux deux longueurs d’onde et suivez les instructions du fabricant pour calculer le pourcentage de réduction du réactif de viabilité cellulaire par les cellules. Représenter graphiquement et analyser statistiquement les résultats de viabilité cellulaire à l’aide d’un logiciel approprié. Entrez des valeurs biologiques triples pour produire des barres d’erreur et indiquer la variabilité du dosage. Pour examiner les changements dans la viabilité cellulaire au cours de la période expérimentale, effectuez un test d’analyse de variance (ANOVA) à un facteur avec de multiples comparaisons des moyennes à l’aide d’un logiciel biostatistique approprié. Indiquez les différences significatives entre les points temporels sur les graphiques sous la forme ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) et **** (P≤0,0001). Figure 4 : Récupération d’échafaudages pour différentes analyses à chaque point temporel. (A) Trois répétitions d’échafaudage sont prélevées pour l’analyse de la viabilité cellulaire. (B) Ces échafaudages peuvent ensuite être lavés dans du PBS, placés dans du Triton X-100 à 1 % dans du NaHCO3 à 0,1 M et stockés à -80 °C pour la quantification de l’ADN. (C) Trois autres répétitions sont fixées dans du PFA à 10 % pendant 15 min, neutralisées dans du PBS et stockées à 4 °C pour coloration histologique et imagerie. (D) Enfin, 3 répétitions sont ajoutées à un réactif de lyse cellulaire à base de phénol/guanidine et stockées à -20 °C pour l’analyse de l’expression génique. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate ; PFA = paraformaldéhyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Quantification de l’ADN des cellules dans les échafaudagesNOTA : Comme mentionné dans la note après l’étape 5.1.7, la récupération des échafaudages pour la quantification de l’ADN consiste à placer les échafaudages dans des tubes à centrifuger de 2 mL contenant 1 mL de Triton X-100 à 1 % dans une solution de NaHCO3 à 0,1 M, puis à les entreposer à -80 °C. Avant que l’analyse de l’ADN puisse être effectuée, les cellules doivent subir trois cycles de gel-dégel pour lyser les cellules du neuroblastome de manière appropriée et libérer de l’ADN pour la quantification.Retirez les échantillons précédemment stockés dans le Triton X-100 à -80 °C. Laisser les échantillons à l’état RT pendant 1 à 3 h ou jusqu’à ce qu’ils soient décongelés. Vaporiser les échantillons pendant 10 à 20 s et les remettre à -80 °C pendant 18 à 24 h ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement congelés. Répétez ce processus pour un total de trois cycles de gel-dégel. Pour maximiser le rendement en ADN, utilisez un lyseur de tissus pour perturber les cellules dans les échafaudages.Placez une bille métallique dans le tube à centrifuger de 2 ml contenant un échafaudage en Triton X-100 et placez le tube dans l’adaptateur pour agiter l’échantillon à 50 oscillations/seconde pendant 2 à 3 minutes.REMARQUE : Utilisez des tubes à centrifuger à fond rond car le cordon métallique peut se loger dans un tube à fond conique. Quantifier l’ADN dans la solution Triton X-100 en appliquant une coloration fluorescente d’ADN double brin (ADNdb) et mesurer l’émission à l’aide d’un lecteur de microplaques. Reportez-vous aux directives du fabricant ; diluer les échantillons de manière appropriée dans un tampon d’acide tétraacétique (TE) Tris-éthylènediamine pour préparer 8 étalons d’ADNdb par dilution en série dans un tampon TE (Figure 5). Dans les plaques noires opaques à 96 puits, ajouter 100 μL de chaque étalon ou échantillon dans les puits en trois exemplaires techniques. Diluer la coloration fluorescente de l’ADNdb 200 fois dans un tampon TE et ajouter 100 μL à chaque étalon/échantillon à l’aide d’une pipette multicanal. Couvrir l’assiette de papier d’aluminium et incuber à RT pendant 5 min. Mesurez et enregistrez la fluorescence de chaque puits à 520 nm. Suivez les directives du fabricant pour calculer la concentration d’ADN dans chaque échantillon.REMARQUE : Si la concentration moyenne d’ADN par cellule est connue pour la lignée cellulaire utilisée, les valeurs de concentration d’ADN peuvent être converties en nombre de cellules à l’aide de l’équation (4).(4) Représenter graphiquement et analyser statistiquement les résultats de la quantification de l’ADN à l’aide d’un logiciel approprié. Entrez des valeurs biologiques triples pour produire des barres d’erreur et indiquer la variabilité du dosage. Pour examiner les changements dans la concentration d’ADN/nombre de cellules au cours de la période expérimentale, effectuez un test ANOVA à un facteur avec plusieurs comparaisons des moyennes à l’aide d’un logiciel biostatistique approprié. Indiquez les différences significatives entre les points temporels sur les graphiques sous la forme ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) et **** (P≤0,0001). Figure 5 : Préparation de huit étalons d’ADN pour la génération d’une courbe standard. Une solution mère d’ADNλ est fournie à raison de 100 μg/mL. Celui-ci est dilué 50 fois dans un tampon TE pour créer l’étalon A à 2000 ng/mL ; 400 μL de A sont ensuite transférés dans le tube B, contenant 400 μL de tampon TE ; 400 μL de B sont ensuite transférés et dilués 2 fois dans C, et ainsi de suite jusqu’à G. La norme H est composée uniquement de tampon TE et a donc une concentration d’ADN de 0 ng/mL. Abréviation : TE = Tris-EDTA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Préparation d’échafaudages pour la coloration histologiqueREMARQUE : Les échafaudages peuvent être fixés et colorés à des fins de microscopie et d’imagerie, soit sous forme d’échafaudages entiers pour l’immunofluorescence (IF), soit sous forme de tranches fixées au formol enrobées de paraffine (FFPE) pour la coloration histologique ou l’immunohistochimie (IHC). Cela permet l’évaluation qualitative de la pénétration et de la distribution cellulaires dans les échafaudages et peut être utilisé pour évaluer l’expression des protéines.Préparez une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 10 % dans du PBS. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de solution pour un volume final de 500 μL par échafaudage. Préchauffer cette solution à 37 °C et ajouter 500 μL dans des tubes à centrifuger de 2 mL étiquetés pour la récupération de l’échafaudage. Retirez les échafaudages des plaques à 24 puits non adhérentes (étape 4.4.4) et placez-les dans la hotte à flux laminaire. À l’aide d’une pince à épiler stérile, transférez les échafaudages dans les tubes à centrifuger étiquetés contenant 10 % de PFA. Laissez les échafaudages se fixer dans la solution de PFA pendant 15 min. Neutraliser le PFA en ajoutant 500 μL de PBS dans chaque tube et conserver à 4 °C. Pour préparer les échafaudages pour le préparateur automatique de tissus, retirez-les de 4 °C et placez-les au crayon à l’aide d’une pince à épiler dans des cassettes en plastique étiquetées avec tous les détails pertinents. Placez toutes les cassettes dans le récipient métallique du processeur de tissus. Commencez le protocole en 12 étapes sur le processeur de tissus pour fixer, déshydrater, nettoyer les échafaudages et les infiltrer avec de la paraffine pendant la nuit. Récupérez les cassettes contenant les échantillons traités. Ensuite, intégrez les échafaudages dans des blocs de cire de paraffine pour permettre la microtomie des échafaudages en tranches très minces pour la coloration.REMARQUE : Il est particulièrement important de tenir compte de l’orientation des échafaudages lors de leur retrait des cassettes et de leur encastrement dans la cire, car cela affectera l’angle auquel les images sont prises. Ceci est important lors de l’évaluation de l’infiltration cellulaire dans les échafaudages. Allumez l’embedder de cire et la plaque froide ; Soulevez le couvercle pour vérifier le niveau de la cire. Remplissez-le si nécessaire. En travaillant avec un échantillon à la fois, ouvrez la cassette, retirez l’échafaudage et centrez-le dans le moule en plastique. Versez de la cire chaude sur l’échantillon, en veillant à maintenir une orientation correcte et en ajustant avec une pince à épiler chaude, si nécessaire, avant que la cire ne se solidifie. Versez plus de cire pour remplir le moule. Placez le couvercle de la cassette étiquetée sur le dessus du moule en plastique et ajoutez de la cire sur le dessus. Placez le moule sur la plaque froide pour solidifier la cire. Conserver toute la nuit à 4 °C pour s’assurer que la cire de paraffine est complètement solidifiée avant la microtomie. Pour vous préparer à la microtomie, allumez un bain-marie à 35 °C, la plaque de séchage et le microtome. Insérez une lame dans le support et serrez le levier pour le fixer. Définissez l’épaisseur de la garniture et de la section, généralement 5 mm pour les sections d’échafaudage. Retirez l’échafaudage FFPE du moule, fixez-le dans le support à l’avant du microtome et coupez soigneusement l’excès de cire sur les bords de l’échantillon avant de couper les sections. Commencez à découper le bloc de cire en tournant le levier du microtome, en assurant un mouvement fluide. Rassemblez des sections en forme de ruban, environ 3 sections d’échafaudage à la fois, et placez-les délicatement dans le bain-marie à 35 °C pour éliminer les plis. Séparez délicatement les sections dans le bain-marie à l’aide d’une pince à épiler. À l’aide de lames de microscope en verre recouvertes de polysine, soulevez chaque section du bain-marie de manière à ce qu’elle repose au centre de la lame. Étiquetez chaque diapositive à l’aide d’un crayon. Placez les lames de verre sur la plaque de séchage ou dans un four de séchage à 60 °C. Une fois séchés, conservez-les à 4 °C et procédez à la coloration histologique ou IHC requise. Récupération d’échafaudages pour l’analyse de l’expression géniqueRetirez les échafaudages des plaques à 24 puits non adhérentes de l’incubateur (étape 4.4.4) et placez-les dans la hotte à flux laminaire. À l’aide d’une pince à épiler stérile, transférer les échafaudages dans des tubes à centrifuger de 2 ml fraîchement étiquetés. Dans une hotte, ajoutez 1 mL d’un réactif de lyse cellulaire à base de phénol/guanidine dans chaque tube pour lyser les cellules dans des échafaudages et permettre la récupération d’ARN de haute qualité. Conservez les tubes à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit approprié. À l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse standard (RT-qPCR)17, évaluer l’expression des gènes dans les cellules des échafaudages.