Driedimensionaal in vitro biomimetisch model van neuroblastoom met behulp van op collageen gebaseerde steigers

1. Experimenteel ontwerp OPMERKING: Het aantal steigers en cellen dat nodig is voor elk experiment is afhankelijk van de schaal van het experiment en kan worden berekend met behulp van de tools in deze sectie over experimenteel ontwerp. Aantal benodigde steigersBepaal de algemene experimentele tijdlijn en beoordelingsintervallen voor veranderingen in de celbiologie (bijv. celgroei en metabolisme).OPMERKING: Het experimentele tijdsbestek is bijvoorbeeld 14 dagen, met elke 7 dagen een beoordeling van de celgroei. De experimentele tijdstippen zijn dus dag 1, 7 en 14, wat een totaal van 3 tijdstippen oplevert. Bepaal vervolgens het aantal experimentele toepassingen dat op elk tijdstip moet worden toegepast. Probeer op elk moment dezelfde analyses uit te voeren om de veranderingen te monitoren.OPMERKING: Typische analyses van celgroei op steigers omvatten cellevensvatbaarheidstests, DNA-kwantificering, histologische kleuring en beeldvorming, en genexpressieanalyse. Deze zullen in hoofdstuk 5 verder worden besproken. Beslis wanneer dezelfde steiger moet worden gebruikt voor meerdere stroomafwaartse toepassingen, bijv. na beoordeling van de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een geschikte test, de steiger hergebruiken voor DNA/RNA-isolatie (besproken in 5.1.11). Houd minimaal 3 biologische replicaten voor elke toepassing, bijv. 3 steigers voor cellevensvatbaarheid en DNA-kwantificering, 3 voor histologie en 3 voor genexpressie-analyse. Aangezien dit gelijk is aan 9 steigers per tijdstip, moet u 27 steigers gebruiken voor 3 tijdstippen. Vermenigvuldig ten slotte dit aantal met het aantal experimentele parameters of omstandigheden (bijv. beoordeling van meerdere cellijnen, initiële zaaidichtheden, steigersamenstellingen).OPMERKING: In dit protocol werden 4 verschillende initiële zaaidichtheden beoordeeld voor één cellijn, wat resulteerde in 108 (27 steigers x 4 voorwaarden) steigers die nodig waren. Om rekening te houden met menselijke fouten en extra dekking te geven, voegt u ~10% toe aan dit aantal, bijv. als er 108 steigers nodig zijn, bereid dan 120 steigers voor. Aantal benodigde cellenOPMERKING: Een volume van 20 μL celsuspensie wordt aanbevolen voor het zaaien van cellen op een cilindrische steiger (diameter 6 mm, hoogte 4 mm) op dag 0. Het aantal cellen per deze 20 μL celsuspensie wordt aangepast volgens de experimentele opzet, berekend in punt 1.1. Een gebruikelijke initiële zaaidichtheid is 2 × 105 cellen per 20 μL, gebruikt als voorbeeld voor het onderstaande protocol.Om de totale hoeveelheid cellen te berekenen die nodig is voor het experiment, vermenigvuldigt u de eerste 2 × 105 cellen per 20 μL met het aantal benodigde steigers.OPMERKING: Bijvoorbeeld, 30 steigers vermenigvuldigd met 20 μL geeft een totaal volume van 600 μL. Als elke steiger 2 × 10 5 cellen nodig heeft, bevat 600 μL suspensie in totaal 6 × 10 6 cellen (2 × 105 × 30), wat een eindbehoefte van 6 × 106 cellen in 600 μL oplevert. Het aantal experimentele parameters bepaalt het totale aantal benodigde cellen. Dit protocol schetst daarom de celkweek met behulp van een meerlagige celkweekkolf, die hetzelfde aantal cellen aankan als 10 traditionele kolven van 175cm2. 2. Voorbereiding van steigers op basis van collageen OPMERKING: Coll-I-nHA en Coll-I-GAG cilindrische steigers (diameter 6 mm, hoogte 4 mm) worden bereid met behulp van vastgestelde methoden 15,21,27. Eenmaal chemisch verknoopt volgens eerder gepubliceerde methoden17, moeten de steigers binnen 1 week worden gebruikt. Zorg er na de fabricage van de steigers met de gewenste mechanische eigenschappen voor dat de steigers volledig gehydrateerd zijn en grondig worden gewassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).OPMERKING: Dit duurt over het algemeen ~12 uur na het vernetten van de steigers en kan worden uitgevoerd in weefselkweekafvalcontainers van 100 ml bij 4 °C, met een maximum van 50 steigers per container en 2 ml PBS per steiger. Bewaar de steigers in PBS bij 4 °C tot gebruik. 3. Vermeerder neuroblastoomcellen in een meerlagige celkweekkolf OPMERKING: De optimale zaaidichtheid voor de meerlagenkolf zal variëren. Voor de kolf die in dit experiment wordt gebruikt, is de optimale dichtheid volgens de instructies van de fabrikant 1 × 107 cellen. Alvorens de meerlagenkolf te zaaien, vermeerdert u de cellen tot een dichtheid van 1 × 107 cellen of hoger in een geschikte weefselkweekkolf (bv. een weefselkweekkolf T175 cm2 ). Om cellen in de meerlagige kolf te zaaien (sectie 3.1), kweekt u ze tot 70-80% samenvloeit, oogst en telt u het aantal cellen per ml, verwijzend naar de stappen 3.2.16-3.2.20 voor het uitvoeren van het celgetal. Zodra de celsuspensie is geteld, gaat u onmiddellijk over tot het zaaien van de meerlagenkolf. Celkweekwerkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap om de steriliteit te behouden. Zaaien van de meerlagige celkweekkolfVerwarm 550 ml volledig groeimedium (varieert afhankelijk van de gebruikte cellijn) en 100 ml steriele PBS gedurende 20 minuten in een waterbad van 37 °C. Bereken met behulp van de geoogste celsuspensie het vereiste volume van de celsuspensie dat nodig is om de optimale zaaidichtheid van 1 × 107 cellen te bereiken met behulp van vergelijking (1), waarbij WANT verwijst naar het aantal cellen dat nodig is voor het zaaien van de meerlagige kolf, en HAVE verwijst naar het aantal cellen/ml in de celsuspensie:(1)bijvoorbeeld. Voeg het benodigde volume van de celsuspensie toe aan 100 ml van het voorverwarmde groeimedium. Neem een nieuwe meerlagige kolf in de kap, verwijder de dop en houd de kolf in een hoek van 60°. Pipetteer langzaam alle 100 ml van de celsuspensie in de kolf, langs de schuine kant van de hals. Sluit de kolf af en leg hem op zijn kant zodat de cellen gelijkmatig over de lagen kunnen worden verdeeld. Voeg onder een hoek van 60° 400 ml van het voorverwarmde groeimedium toe aan de meerlagenkolf door langzaam langs de schuine kant van de hals te gieten of te pipetteren. Als de hals vol raakt, zet u de kolf weer rechtop, of sluit u de kolf af en legt u deze op zijn kant voordat u weer gaat schenken.NOTITIE: Giet langzaam om overmatige luchtbelvorming te voorkomen. Tik zachtjes rechtop op de kolf om alle belletjes naar boven te laten komen en verwijder ze met een pipet van 10 ml. Zorg ervoor dat de kolf tot aan de onderste draad van de hals is gevuld; Voeg indien nodig meer medium toe om dit te bereiken. Sluit de meerlagenkolf af en broed deze uit met de schuine hals naar beneden gericht bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid. Controleer de groei elke 2-3 dagen op samenvloeiing. Om de samenvloeiing van de onderste twee lagen van de meerlagige kolf te controleren, bekijkt u ze onder een 4x objectieflens van een omgekeerde microscoop.OPMERKING: Wanneer de 10-laagse kolf is bezaaid met 1 × 107 neuroblastoomcellen, duurt het doorgaans een week voordat de 10-laagse kolf samenvloeit, hoewel dit kan variëren afhankelijk van de gebruikte cellijn. Routineonderhoud van de cellen in de meerlagenkolfVerwarm 550 ml volledig groeimedium (varieert afhankelijk van de gebruikte cellijn), 50-100 ml trypsine en 300 ml steriele PBS voor in een waterbad van 37 °C gedurende 20 minuten. Controleer de meerlagige kolf op 70-80% samenvloeiing. Plaats de meerlaagse kolf in een laminaire stroomkap en gooi het verbruikte medium uit de kolf door te gieten. Kantel de kolf in eerste instantie zodat het medium over de luchtdam in een afvalcontainer stroomt. Draai tijdens het schenken de kolf 180° totdat het medium langs de schuine hals van de kolf stroomt. Draai de kolf heen en weer langs deze as om eventuele resterende vloeistof te verwijderen. Was de cellen door 100 ml voorverwarmde steriele PBS langzaam in de schuine hals toe te voegen. Sluit de kolf af, leg hem op zijn kant om een gelijkmatige verdeling van PBS mogelijk te maken en draai de kolf heen en weer om de cellen te wassen. Gooi de PBS-was op dezelfde manier weg als 3.2.3. Herhaal de wasstappen. Verdun 50 ml van de voorverwarmde trypsine in 50 ml voorverwarmde steriele PBS. Voeg 100 ml verdunde trypsineoplossing toe aan de meerlagige kolf, dop en plaats de kolf op zijn kant om een gelijkmatige verdeling van de trypsine mogelijk te maken. Als de cellijn sterk hecht is, gebruik dan 100 ml onverdunde trypsine. Incubeer de kolf gedurende 2-5 minuten bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid, waarbij u de celloslating onder de microscoop controleert. Tik indien nodig stevig op de kolf om het losmaken te vergemakkelijken of plaats hem nog een minuut terug in de couveuse. Plaats de meerlagenkolf in een laminaire stroomkap en neutraliseer de trypsine met 100 ml groeimedium. Sluit de kolf af, leg hem op zijn kant en schommel heen en weer om volledige neutralisatie te garanderen. Giet de geneutraliseerde celsuspensie af in 4 x 50 ml conische centrifugebuisjes.OPMERKING: Als een volledige celoogst vereist is, was de meerlagige kolf dan opnieuw met 100 ml steriele PBS en giet deze af in 2 centrifugebuisjes van 50 ml. Centrifugeer de celsuspensie in centrifugebuisjes van 50 ml bij 340 × g gedurende 3-4 minuten om de cellen te pelleteren. Plaats de centrifugebuisjes terug in de laminaire stromingskap en gooi voorzichtig zoveel mogelijk supernatant van elke pellet weg.NOTITIE: De pellet zal groot en relatief los zijn en kan daarom gemakkelijk worden verstoord. Voeg 1-5 ml groeimedium toe aan elke pellet en resuspendeer deze door meerdere keren op en neer te pipetteren. Doe de 4 geresuspendeerde pellets samen in een centrifugebuis van 50 ml, meng ze grondig met de pipet en noteer het totale volume. Maak een geschikte verdunning van de celsuspensie voor het tellen van cellen, zodat elk buitenste vierkant op de hemocytometer 30-100 cellen bevat.OPMERKING: Een geschikte startverdunning is 1:100; pipetteer hiervoor 10 μL van de celsuspensie in een verse conische centrifugebuis van 15 ml en verdun deze met 990 μL steriele PBS. Pipetteer het mengsel meerdere keren op en neer om goed te mengen. Plaats tijdens het tellen een centrifugebuisje van 50 ml met daarin de celvoorraad in de incubator. Neem een schone hemocytometer en plaats een schoon dekglaasje over het rooster, zoals weergegeven in figuur 2. Pipetteer 10 μl van de verdunde celsuspensie in de hemocytometerkamer. Als de kamer vol raakt voordat alle 10 μL is afgegeven, stop dan met pipetteren. Plaats de hemocytometer onder het 4x objectief van een lichtmicroscoop. Pas de grove en fijne focus aan om de cellen te visualiseren. Tel het aantal cellen in de vier buitenste hoekvierkanten van de kamer, zoals gemarkeerd in figuur 2. Tel de vier tellingen bij elkaar op en deel door 4 om het gemiddelde aantal cellen per vierkant te berekenen. Figuur 2: Celtelling met behulp van een hemocytometer. Tien microliter celsuspensie wordt toegevoegd aan de hemocytometer onder het dekglaasje. De kamer wordt vervolgens onder de 4x objectieflens van een microscoop geplaatst en het aantal cellen in de vier buitenste hoeken van het raster wordt geteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Vermenigvuldig het gemiddelde aantal met de verdunningsfactor (bijv. 100) en vermenigvuldig dit aantal met 10.000 om het aantal cellen per ml te verkrijgen met behulp van vergelijking (2). (2) Bereken het totale aantal cellen in de stockoplossing door te vermenigvuldigen met het totale volume van de celstock (bijv. als de 4 geresuspendeerde pellets een oplossing van 20 ml hebben gemaakt, vermenigvuldig dan de cellen/ml met 20). Om de meerlagenkolf in stand te houden, berekent u aan de hand van vergelijking (1) in stap 3.1.2 het volume van de celvoorraad dat nodig is om 1 × 107 cellen terug in de kolf te zaaien en voert u de stappen 3.1.3-3.1.6 uit om de kolf opnieuw in te zaaien. Als u klaar bent om de steigers te zaaien, gaat u verder met het volgende gedeelte. 4. Zaad neuroblastoomcellen op steigers Bereid de suspensie van de voorraadcellen voorOPMERKING: Dit protocol schetst de stappen voor het creëren van vier verschillende zaaidichtheden van neuroblastoomcellen, met een vermenigvuldigingsfactor van 2 tussen elke dichtheid. Een seriële verdunning zal daarom worden gebruikt om nog drie celsuspensies uit de stocksuspensie te maken. Celkweekwerkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap om de steriliteit te behouden.Gebruik vergelijking (3) om het volume van de cellen te berekenen dat nodig is op basis van het totale aantal cellen in de meerlagenkolf (geteld in punt 3.2.19) om de eerste zaaidichtheid of de suspensie van de celvoorraad voor te bereiden.(3)OPMERKING: Als de hoogste zaaidichtheid bijvoorbeeld 6 × 10 5 cellen per steiger is die nodig is voor 30 steigers, waarbij elke steiger 20 μL celsuspensie krijgt, zou de standaardcelsuspensie 1,8 × 107 cellen (6 × 105 cellen × 30 steigers) nodig hebben in een totaal volume van 600 μL (20 μL × 30 steigers).Aangezien met dit preparaat een seriële verdunning zal worden uitgevoerd, moeten deze aantallen worden verdubbeld, d.w.z. 3,6 × 107 cellen in een totaal volume van 1200 μL. Om dit om te zetten naar WANT in cellen per ml; deel 3,6 × 10 7 door 1200 μL en vermenigvuldig met 1000 μL, wat 3 × 107 cellen per ml oplevert.​ Voeg het benodigde volume celvoorraad toe aan een steriele centrifugebuis van 2 ml of 15 ml en breng tot een eindvolume van 1200 μl met groeimedium. Label deze buis als Dichtheid 1 (Figuur 3). Voer seriële verdunning uit om celsuspensies met meerdere zaaddichtheid te creëren.Bereid vanaf dichtheid 1 die in stap 4.1.1 is voorbereid, nog drie dichtheden van celsuspensie door middel van seriële verdunning zoals beschreven in figuur 3. Verdun elke dichtheid met een factor 2 in het groeimedium. Voeg eerst het benodigde eindvolume (600 μL uit het vorige voorbeeld) groeimedium toe aan drie steriele centrifugebuisjes van 2 ml of 15 ml. Breng de helft van dichtheid 1 (600 μL) over naar een van de buizen en meng de celsuspensie grondig met het medium om te verdunnen. Label deze buis als Density 2. Breng de helft van Density 2 (600 μL) over naar de volgende buis en meng de celsuspensie grondig met het medium om te verdunnen. Label deze buis als Density 3. Breng de helft van dichtheid 3 (600 μL) over naar de volgende buis en meng de celsuspensie grondig met het medium om te verdunnen. Label deze buis als Density 4. Gooi 600 μL van dichtheid 4 weg, zodat alle vier de preparaten een eindvolume van 600 μl hebben. Voeg als negatieve controle 600 μL groeimedium toe aan een steriele centrifugebuis van 2 ml. Zie figuur 3 voor een schema van het seriële verdunningsproces. Figuur 3: Seriële verdunning van celmateriaal om 4 suspensies te bereiden voor 4 verschillende scaffold seeding-dichtheden. (A) Aantallen kunnen worden aangepast aan de gewenste zaaidichtheid per steiger en (B) vermenigvuldigd voor het totale aantal steigers per dichtheid, waarbij elke steiger 20 μL celsuspensie krijgt. In dit voorbeeld vereist dichtheid 1 6 × 105 cellen per steiger, wat overeenkomt met 1,8 × 107 cellen in 600 μL voor 30 steigers. Dit aantal wordt verdubbeld om de seriële verdunning te starten, aangezien 600 μL vervolgens wordt overgebracht en verdund in 600 μL groeimedium in de volgende buis. Dit proces gaat door totdat er 4 celsuspensies zijn met een factor 2 ertussen. Een negatieve controle wordt uitgevoerd door slechts 600 μL medium aan een buis toe te voegen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Toevoegen van celsuspensies aan de steigersNOTITIE: Haal de steigers (bewaard in PBS) uit de koelkast en laat ze op kamertemperatuur komen (RT) voordat u de cellen toevoegt.Breng de steigers in PBS in de laminaire stroomkap. Plaats de steigers met een steriel pincet in niet-klevende platen met 24 putjes en één steiger per putje (Figuur 1C). Til de steigers voorzichtig aan de hoeken op en druk ze lichtjes tegen de zijkant van de container om overtollig PBS te verwijderen. Voeg de steigers toe aan het midden van de putten met de huid naar beneden (de glanzende laagzijde van de steiger, naar beneden gericht in de plastic platen met 24 putjes). Label de platen met 24 putjes met details van de cellijn, relevante parameters (bijv. zaaidichtheid) en tijdstippen. Werk met één celzaaidichtheid per keer en bewaar de resterende dichtheden in de incubator van 37 °C tot ze klaar zijn voor gebruik. Gebruik in de laminaire stromingskap een P20-pipet en steriele tips om voorzichtig 20 μL van de relevante celsuspensie toe te voegen aan het midden van elke steiger (Figuur 1D). Houd de cellen goed in suspensie door goed te mengen terwijl je de cellen aan de steigers toevoegt. Zorg ervoor dat de ophanging bovenop de steiger blijft en niet op de basis van de put glijdt, omdat hierdoor geen celbevestiging aan de steiger mogelijk is. Nadat de cellen zijn toegevoegd, incubeert u de platen gedurende 3-5 uur (37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid) zodat de meeste cellen zich kunnen hechten. Voeg na de incubatie langzaam en voorzichtig 1 ml voorverwarmd groeimedium toe aan elk putje (Figuur 1E). Gebruik een P1000-pipet om het medium toe te voegen om een langzamere en gecontroleerde beweging mogelijk te maken, waardoor verplaatsing van de steigers wordt voorkomen. Als u met een zeer groot aantal steigers werkt, gebruik dan een pipet van 10 ml met het pipetpistool ingesteld op ‘drop’ en ‘low’. Incubeer de platen met 24 putjes een nacht (37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid). Onderhoud van cellen op de steigersBreng na de eerste 24 uur van celhechting (dag 1) de gezaaide steigers over naar nieuwe niet-klevende platen met 24 putjes en voeg 1-2 ml vers groeimedium toe.OPMERKING: Deze stap verwijdert cellen die naar de bodem van de plastic platen met 24 putjes zijn gevallen in plaats van ze op de steigers te laten groeien. Replica’s van steigers die zijn aangewezen als dag 1 worden na 24 uur afgebroken, zoals besproken in sectie 5; Onderhoud is dus niet van toepassing op deze steigers. Controleer de steigers in eerste instantie om de 2-3 dagen op een verandering in kleur van het groeimedium. Naarmate de tijd vordert en cellen zich in de steigers vermenigvuldigen, voedt u de cellen vaker. Gebruik een pipetpistool van 10 ml, in de langzame modus, verwijder de 1 ml van het verbruikte medium en gooi het weg. Als u experimenten uitvoert waarvoor geconditioneerd medium nodig is, verzamel dan het gebruikte medium van biologische replicaten in een centrifugebuis van 15 ml, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 340 × g om het celafval te pelleteren, breng het supernatans over in een nieuwe buis en bewaar het bij -80 °C. Voeg voorzichtig 2 ml voorverwarmd groeimedium toe aan de steigers, gebruik opnieuw de druppelfunctie op de pipet en plaats de plaat met 24 putjes terug in de incubator (37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid). Herhaal dit wanneer het medium wordt gebruikt voor de duur van de gewenste groeiperiode. 5. Ophalen en toepassingen van steigers OPMERKING: Op elk tijdstip kunnen verschillende toepassingen worden gebruikt om de celgroei op de steigers te volgen of gen- en eiwitexpressieprofielen te beoordelen. De omstandigheden voor het ophalen van steigers zijn afhankelijk van de uit te voeren analyse, waarbij meerdere ophaalmethoden worden beschreven in de volgende subparagrafen en worden gedemonstreerd in figuur 4. Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen in steigersSteriliseer het juiste reagens voor de cellevensvatbaarheidstest door door een steriel filter van 0,2 μm in een centrifugebuis in de laminaire stroomkap te filteren. Verwarm deze steriele oplossing samen met het volledige groeimedium en de steriele PBS voor in een waterbad van 37 °C. Gebruik in de laminaire stroomkap een steriel pincet om de te analyseren steigers over te brengen naar een verse plaat met 24 putjes. Label het bord met alle relevante details.OPMERKING: Voer de analyse in drievoud uit. Voeg 900 μL van het voorverwarmde groeimedium toe aan elk putje, gevolgd door 100 μL van het steriele cellevensvatbaarheidsreagens. Voer een negatieve controle uit door 900 μl medium en 100 μl van het reagens voor de levensvatbaarheid van steriele cellen toe te voegen aan een putje zonder steiger. Plaats het deksel terug op de plaat en schud de plaat voorzichtig gedurende ~3 minuten om het verdunde reagens voor de levensvatbaarheid van de cellen gelijkmatig over het putje te verdelen. Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid.OPMERKING: De incubatietijd moet voor elke cellijn worden geoptimaliseerd; Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant. Voor neuroblastoomcellijnen lijkt een incubatietijd van 4-6 uur optimaal. Haal na het broeden de plaat uit de couveuse en schud hem een paar seconden voorzichtig. Open in de laminaire stroomkap een nieuwe, doorschijnende plaat met 96 putjes. Breng van elk putje in de plaat met 24 putjes het geïncubeerde medium en het reagens over naar drie putjes van de plaat met 96 putjes met 100 μl per putje, wat technische drievoud oplevert.OPMERKING: Deze overdracht laat 700 μL achter in de putjes van de plaat met 24 putjes. Bedek de plaat met 96 putjes met aluminiumfolie om het reagens voor de levensvatbaarheid van de cel tegen licht te beschermen. Verwijder de resterende 700 μL van de putinhoud van elke steiger in de plaat met 24 putjes en gooi deze weg. Was elke steiger twee keer met 1 ml steriele PBS.OPMERKING: Alle kleur wordt niet van de steigers verwijderd. Deze steigers kunnen vervolgens worden gebruikt voor verdere toepassingen, bijvoorbeeld DNA-kwantificering, door ze in 1 ml 1% Triton X-100 in 0,1 M natriumbicarbonaat (NaHCO3)-oplossing te plaatsen en ze op te slaan bij -80 °C (zie rubriek 5.2, figuur 4B). Verwijder de plaat met 96 putjes van de laminaire stromingskap en meet de absorptie van elk putje op golflengten van 570 nm en 600 nm met behulp van een microplaatlezer. Noteer de absorptiewaarden op beide golflengten en volg de instructies van de fabrikant om de procentuele vermindering van het cellevensvatbaarheidsreagens door de cellen te berekenen. Maak een grafiek en analyseer statistisch de resultaten van de levensvatbaarheid van de cel met behulp van geschikte software. Voer biologische drievoudige waarden in om foutbalken te produceren en de variabiliteit van de test aan te geven. Om veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen gedurende het experimentele tijdsbestek te onderzoeken, voert u een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA)-test uit met meerdere vergelijkingen van de gemiddelden met behulp van geschikte biostatistische software. Geef significante verschillen aan tussen de tijdstippen op grafieken als ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) en **** (P≤0,0001). Figuur 4: Ophalen van steigers voor verschillende analyses op elk tijdstip. (A) Er worden drie replicaten van de steiger opgehaald voor analyse van de levensvatbaarheid van de cel. (B) Deze steigers kunnen vervolgens worden gewassen in PBS, in 1% Triton X-100 in 0,1 M NaHCO3 worden geplaatst en bij -80 °C worden bewaard voor DNA-kwantificering. (C) Nog drie replicaten worden gedurende 15 minuten gefixeerd in 10% PFA, geneutraliseerd in PBS en opgeslagen bij 4 °C voor histologische kleuring en beeldvorming. (D) Ten slotte worden 3 replicaten toegevoegd aan een cellysereagens op basis van fenol/guanidine en opgeslagen bij -20 °C voor analyse van genexpressie. Afkortingen: PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; PFA = paraformaldehyde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Kwantificering van DNA uit de cellen in de steigersOPMERKING: Zoals vermeld in de opmerking na stap 5.1.7, omvat het ophalen van de steigers voor DNA-kwantificering het plaatsen van de steigers in centrifugebuisjes van 2 ml met 1 ml 1% Triton X-100 in 0,1 M NaHCO3-oplossing , gevolgd door opslag bij -80 °C. Voordat DNA-analyse kan worden uitgevoerd, moeten de cellen drie vries-dooicycli ondergaan om de neuroblastoomcellen op de juiste manier te lyseren en DNA vrij te geven voor kwantificering.Verwijder de monsters die eerder in Triton X-100 zijn opgeslagen bij -80 °C. Laat de monsters 1-3 uur bij RT staan of tot ze ontdooid zijn. Draai de monsters gedurende 10-20 s en plaats de monsters terug bij -80 °C gedurende 18-24 uur of totdat ze volledig bevroren zijn. Herhaal dit proces voor in totaal drie vries-dooicycli. Om de DNA-opbrengst te maximaliseren, gebruikt u een weefsellyser om de cellen in de steigers te verstoren.Plaats een metalen kraal in de centrifugebuis van 2 ml met daarin een steiger in Triton X-100 en plaats de buis in de adapter om het monster gedurende 2-3 minuten met 50 oscillaties/seconde te schudden.NOTITIE: Gebruik centrifugebuisjes met ronde bodem, aangezien de metalen hiel vast kan komen te zitten in een buis met taps toelopende bodem. Kwantificeer het DNA in de Triton X-100-oplossing door een fluorescerende dubbelstrengs DNA-kleuring (dsDNA) aan te brengen en meet de emissie met behulp van een microplaatlezer. Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant; verdun de monsters op de juiste manier in Tris-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (TE)-buffer om 8 dsDNA-standaarden te bereiden door seriële verdunning in TE-buffer (figuur 5). Voeg in zwarte ondoorzichtige platen met 96 putjes 100 μl van elke standaard of elk monster in technisch drievoud toe aan de putjes. Verdun de fluorescerende dsDNA-kleuring 200-voudig in TE-buffer en voeg 100 μL toe aan elke standaard/monster met behulp van een meerkanaalspipet. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer 5 minuten bij RT. Meet en registreer de fluorescentie van elk putje bij 520 nm. Volg de richtlijnen van de fabrikant om de DNA-concentratie in elk monster te berekenen.OPMERKING: Als de gemiddelde concentratie DNA per cel bekend is voor de cellijn die wordt gebruikt, kunnen DNA-concentratiewaarden worden omgezet in celnummers met behulp van vergelijking (4).(4) Maak een grafiek en analyseer de resultaten van de DNA-kwantificering statistisch met behulp van geschikte software. Voer biologische drievoudige waarden in om foutbalken te produceren en de variabiliteit van de test aan te geven. Om de veranderingen in DNA-concentratie/celaantallen gedurende het experimentele tijdsbestek te onderzoeken, voert u een eenrichtings-ANOVA-test uit met meerdere vergelijkingen van de gemiddelden met behulp van geschikte biostatistische software. Geef significante verschillen aan tussen tijdstippen in grafieken als ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) en **** (P≤0,0001). Figuur 5: Opstellen van acht DNA-standaarden voor het genereren van een standaardcurve. Er wordt een stockoplossing van λDNA geleverd in een dosis van 100 μg/ml. Dit wordt 50-voudig verdund in TE-buffer om standaard A te creëren bij 2000 ng/ml; 400 μL A wordt vervolgens overgebracht naar buis B, die 400 μL TE-buffer bevat; 400 μL B wordt vervolgens overgebracht en 2-voudig verdund in C, enzovoort tot G. Standaard H bestaat alleen uit TE-buffer en heeft daarom een DNA-concentratie van 0 ng/ml. Afkorting: TE = Tris-EDTA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Voorbereiding van steigers voor histologische kleuringOPMERKING: Scaffolds kunnen worden gefixeerd en gekleurd voor microscopie- en beeldvormingsdoeleinden, hetzij als hele steigers voor immunofluorescentie (IF) of als in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) plakjes voor histologische kleuring of immunohistochemie (IHC). Dit maakt de kwalitatieve beoordeling van celpenetratie en -distributie binnen steigers mogelijk en kan worden gebruikt om de expressie van eiwitten te beoordelen.Bereid een 10% paraformaldehyde (PFA)-oplossing in PBS. Zorg ervoor dat er voldoende oplossing is voor een eindvolume van 500 μL per steiger. Verwarm deze oplossing voor op 37 °C en voeg 500 μl toe aan de gelabelde centrifugebuisjes van 2 ml voor het ophalen van de steiger. Verwijder de steigers van de niet-klevende platen met 24 putjes (stap 4.4.4) en plaats ze in de laminaire doorstromingskap. Breng de steigers met een steriel pincet over naar de gelabelde centrifugebuisjes met 10% PFA. Laat de steigers 15 minuten fixeren in de PFA-oplossing. Neutraliseer de PFA door 500 μL PBS aan elk buisje toe te voegen en bewaar bij 4 °C. Om de steigers voor te bereiden op de automatische weefselverwerker, verwijdert u ze van 4 °C en plaatst u ze met een pincet in plastic cassettes die met potlood zijn gelabeld met alle relevante details. Plaats alle cassettes in de metalen container van de Tissue Processor. Begin met het 12-fasenprotocol op de weefselprocessor om de steigers te repareren, uit te drogen, vrij te maken en ze ‘s nachts met paraffine te infiltreren. Verzamel de cassettes met de verwerkte monsters. Veranker vervolgens de steigers in paraffinewasblokken om microtomie van de steigers in zeer dunne plakjes mogelijk te maken om te kleuren.OPMERKING: Het is vooral belangrijk om rekening te houden met de oriëntatie van de steigers wanneer u ze uit de cassettes haalt en in was inbedt, omdat dit van invloed is op de hoek waaronder de foto’s worden gemaakt. Dit is belangrijk bij het beoordelen van celinfiltratie in de steigers. Zet de wax embedder en de koude plaat aan; Til het deksel op om het niveau van de was te controleren. Vul indien nodig bij. Werk met één monster tegelijk, open de cassette, verwijder de steiger en centreer deze in de plastic mal. Giet hete was op het monster, zorg ervoor dat de juiste oriëntatie wordt gehandhaafd en pas indien nodig aan met een warm pincet voordat de was stolt. Giet meer was om de mal te vullen. Plaats het gelabelde cassettedeksel op de plastic mal en voeg er was aan toe. Plaats de mal op de koude plaat om de was te laten stollen. Bewaar een nacht bij 4 °C om ervoor te zorgen dat de paraffinewas volledig gestold is vóór de microtomie. Om u voor te bereiden op microtomie, zet u een waterbad van 35 °C, de droogplaat en de microtoom aan. Steek een mes in de houder en draai de hendel vast om het vast te zetten. Stel de trim- en sectiedikte in, meestal 5 mm voor steigersecties. Haal de FFPE-steiger uit de mal, zet deze vast in de houder aan de voorkant van de microtoom en snijd de overtollige was voorzichtig rond de randen van het monster af voordat u secties snijdt. Begin met snijden in het wasblok door aan de hendel van de microtoom te draaien, zodat u een soepele beweging krijgt. Verzamel lintachtige secties, ongeveer 3 steigersecties tegelijk, en plaats ze voorzichtig in het waterbad van 35 °C om kreukels te verwijderen. Scheid de secties voorzichtig terwijl ze in het waterbad zijn met een pincet. Gebruik microscoopglaasjes van glas met polysininecoating om elke sectie uit het waterbad te tillen zodat de sectie in het midden van het objectglaasje zit. Label elk glaasje met een potlood. Plaats de glasplaatjes op de droogplaat of in een droogoven van 60 °C. Eenmaal gedroogd, bewaar ze bij 4 °C en ga verder met de vereiste histologische of IHC-kleuring. Ophalen van steigers voor genexpressie-analyseVerwijder de steigers van de niet-hechtende platen met 24 putjes uit de incubator (stap 4.4.4) en plaats ze in de laminaire stromingskap. Breng de steigers met een steriel pincet over naar vers geëtiketteerde centrifugebuisjes van 2 ml. Voeg in een zuurkast 1 ml van een op fenol/guanidine gebaseerde cellyse-reagens toe aan elke buis om de cellen in steigers te lyseren en herstel van hoogwaardig RNA mogelijk te maken. Bewaar buisjes bij -20 °C totdat ze klaar zijn om RNA-extractie uit te voeren met behulp van een geschikte kit. Beoordeel met behulp van een standaard reverse-transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)17 de genexpressie in de cellen in de steigers.